Níveis de óxido nítrico mais elevados estão associados à atividade da doença em pacientes egípcios com artrite reumatoide Academic research paper on "Educational sciences"

ELSEVIER

REVISTA BRASILEIRA DE REUMATOLOGIA

www.reumatologia.com.br

SOCIEDADE BRASILEIRA DE REUMATOLOGIA

Artigo original

Níveis de óxido nítrico mais elevados estao associados á atividade da doenca em pacientes egipcios com artrite reumatoide

Adel Mahmoud Ali, Reem Abdelmonem Habeeb *, Noran Osama El-Azizi, Dina Aziz Khattab, Rania Ahmed Abo-Shady e Rania Hamdy Elkabarity

Departamento de Medicina Interna, Divisao de Reumatologia e Departamento de Patologia Clínica, Universidade Ain Shams, Cairo, Egito

CrossMark

informaqoes sobre o artigo

resumo

Histórico do artigo: Recebido em 10 de abril de 2013 Aceito em 6 de julho de 2014 On-line em 28 de setembro de 2014

Palavras-chave: Artrite reumatoide (AR) Estresse oxidativo Óxido nítrico (NO)

Introdujo: O estresse oxidativo produzido no interior de articulacoes inflamadas pode pro-duzir fenómenos autoimunes e destruicao articular. As espécies radicais com atividade oxidativa, incluindo espécies reativas de nitrogenio, representam mediadores de inflamacao e de lesao cartilaginosa.

Objetiuos:Avaliar o óxido nítrico sérico como marcador de estresse oxidativo em pacientes egipcios com artrite reumatoide e sua relacao com a atividade da doenca. Métodos:80 com artrite reumatoide foram divididos em dois grupos, de acordo com a pontuacao DAS28: Grupo I: 42 pacientes com doenca ativa, e Grupo II: 38 pacientes com doenca inativa. Quarenta individuos equiparados por idade e genero foram incluidos como grupo controle (Grupo III). Foram realizados exames laboratoriais de rotina e o óxido nítrico foi medido usando Elisa. Radiografías simples das maos foram feitas para a pontuacao do estado radiológico utilizando o método de Sharpe.

Resultados:A comparacao do nivel sérico de óxido nítrico entre os tres grupos mostrou uma diferencia altamente significativa (p < 0,001). Obtiveram-se níveis significativamente mais elevados entre os pacientes com artrite reumatoide em comparacao com os controles. Os níveis mais elevados foram obtidos em pacientes com a doenca ativa (média ± DP 82,38 ± 20,46) em comparacao com aqueles com a doenca inativa (35,53 ± 7,15). O óxido nítrico no Grupo I exibiu uma correlacao positiva significativa com a rigidez matinal (r = 0,45), artrite (r = 0,43), contagem de plaquetas (r=0,46), velocidade de hemossedimentacao (r= 0,83), proteína C-reativa (r= 0,76) e Índice de Atividade de Doenca (r = 0,85). O óxido nítrico mostrou uma correlacao positiva significativa (r= 0,43) com as radiografías das maos (índice de Sharpe) no Grupo I.

Conclusao:Observa-se um aumento nos níveis séricos de óxido nítrico em pacientes com artrite reumatoide. O óxido nítrico se correlaciona significativamente com a atividade da doenca, marcadores inflamatórios e estado radiológico das articulacoes.

© 2014 Elsevier Editora Ltda. Todos os direitos reservados.

* Autor para correspondencia. E-mail: reemhabeeb@yahoo.com (R.A. Habeeb). http://dx.doi.org/10.10167j.rbr.2014.07.003

0482-5004/© 2014 Elsevier Editora Ltda. Todos os direitos reservados.

Higher nitric oxide levels are associated with disease activity in Egyptian rheumatoid arthritis patients

abstract

Keyu)ords:Background:Oxidative stress generated within inflammatory joints can produce autoim-Rheumatoid arthritis (RA) mune phenomena and joint destruction. Radical species with oxidative activity, including

Oxidative stress reactive nitrogen species, represent mediators of inflammation and cartilage damage.

Nitric oxide (NO) Objectiues:To assess serum nitric oxide as a marker of oxidative stress in Egyptian patients

with rheumatoid arthritis and its relation to disease activity.

Methods: 80 patients with rheumatoid arthritis were divided into 2 groups, according to the DAS-28 score: Group I: 42 patients with disease activity, and Group II: 38 patients with no disease activity. Forty age- and sex-matched individuals were included as control group (Group III). Routine laboratory investigations were done, and nitric oxide was measured using Elisa. Hand plain radiographies were done for radiological status scoring using the Sharp method.

Results: A comparison between nitric oxide in all three groups showed a highly significant difference (p < 0.001), significantly higher levels were obtained among rheumatoid arthritis patients in comparison to controls, and higher levels were obtained in patients with active disease (mean ± SD 82.38 ± 20.46) in comparison to patients without active disease (35.53 ± 7.15). Nitric oxide in Group I showed a significant positive correlation with morning stiffness (r = 0.45), arthritis (r=0.43), platelet count (r = 0.46), erythrocyte sedimentation rate (r=0.83), C-reactive protein (r = 0.76) and Disease Activity Score (r=0.85). Nitric oxide showed a significant positive correlation (r= 0.43) with hand radiographies (Sharp score) in Group I. ConcIusion:There are increased levels of nitric oxide in the serum of patients with rheumatoid arthritis. Nitric oxide correlates significantly with disease activity, inflammatory markers and radiological joint status.

© 2014 Elsevier Editora Ltda. All rights reserved.

Introducáo

O óxido nítrico (NO) é uma pequeña molécula produzida endógenamente que desempenha um papel crítico na sinalizacao celular, e que está envolvida em vários processos fisiológicos. O NO pode ter efeitos biológicos opostos, dependendo de condicoes ambientais e fisiopatológicas diversas.1

O estresse oxidativo produzido dentro de uma articulacao inflamada pode provocar fenómenos autoimunes e destruicao do tecido conjuntivo no interior da sinóvia. Espécies radicais com atividade oxidativa, que incluem espécies reativas de nitrogenio e espécies reativas de oxigenio, representam os mediadores e efetores da lesao da cartilagem.2

O NO promove a mediacao de muitas funcoes celulares diferentes no local da inflamacao sinovial, como por exem-plo a transducao de sinal, a funcao mitocondrial e a apoptose.3 Ele surgiu como um mediador importante na sinóvia na artrite reumatoide (AR). Foi relatado o aumento dos níveis de NO no soro e no líquido sinovial em pacientes com AR, espondilite anquilosante e osteoartrite.4

O objetivo deste trabalho é avaliar o óxido nítrico sérico como marcador de estresse oxidativo em pacientes egípcios com artrite reumatoide e sua relacao com a atividade da doenca.

Métodos

Em um estudo transversal, 80 pacientes com AR, diagnosticados de acordo com os critérios do American College of Rheumatology/European League against Rheumatism (ACR/EULAR),5 foram divididos em dois grupos de acordo com a atividade da doenca: Grupo 1:42 pacientes com doenca ativa e Grupo II: 38 pacientes com doenca inativa. Um terceiro grupo foi incluido, o Grupo III: 40 individuos saudáveis com idade e genero correspondentes, como grupo controle. Todos os pacientes foram recrutados no Ambulatorio de Reumatologia e na Enfermaria de Medicina Interna do Hospital Escola da Universidade Ain Shams. Foi obtido consentimento informado de todos os participantes. O estudo foi aprovado pelo comité de ética da Universidade Ain Shams. Os participantes receberam explicares sobre a natureza do estudo. Os procedimentos laboratoriais e radiológicos representam o tratamento padrao, nao implicando em conflitos éticos. Coletou-se de todos os pacientes:

I. Historia de saúde detalhada e exame clínico e musculos-quelético minucioso, com avaliacao da atividade da doenca pelo instrumento DAS28-VHS:6

Historia detalhada da duracao e progressao da doenca, tendo sido avaliados os sinais e sintomas capitais de febre, perda de peso e fadiga, além de um exame musculoesquelético minucioso.

Tabela 1 - Comparacáo entre os Grupos I e II, no que se refere a dados demográficos, clínicos e laboratoriais

Grupo I Grupo II P

Dados demográficos

Idade, média (DP) 48,78 (12,41) 44,10 (10,54) >0,05

Género, n (%)

Masculino 19 (45) 17 (45) >0,05

Feminino 23 (55) 21 (55) >0,05

Duraçao da doença (anos), média (DP) 5,48 (6,63) 6,59 (5,81) >0,05

Manifestaçôes clínicas

Emagrecimento, n (%) 16 (38) 15 (39) >0,05

Fadiga, n (%) 21(50) 10 (26) <0,001

Febre, n (%) 4(10) 0(0) >0,05

Rigidez matinal, n (%) 36 (85) 13 (34) <0,001

Dados laboratoriais

Hemoglobina, média (DP) 11,06 (1,64) 11,87± 1,61 >0,05

Contagem total de leucocitos, média (DP) 7,68 (2,61) 7,12± 2,38 >0,05

Plaquetas, média (DP) 382,81 (102,24) 261,14± 74,37 <0,05

Velocidade de hemossedimentacao (VHS), média (DP) 60,69 (24,32) 19,76± 5,29 <0,001

Proteína C-reativa (PCR), média (DP) 24,48 (12,64) 8,52 ±3,01 <0,001

Fator reumatoide (FR), n (%) 36 (86) 30 (79) >0,05

Foi observada uma diferenca altamente significativa (p < 0,001) entre os Grupos I e II no que se refere à fadiga (50% e 26%, respectivamente) e à

rigidez matinal (85% e 34%, respectivamente). Foi observada uma diferenca altamente significativa (p < 0,001) entre os Grupos I e II no que diz

respeito à VHS e PCR, com níveis mais elevados para esses dois indicadores detectados no Grupo I.

A atividade da doenca foi avaliada usando o DAS28-VHS. Valores < 2,6 foram considerados como indicativos de ausencia de atividade da doenca.6

II. Exames laboratoriais:

a) Exames laboratoriais de rotina: Hemograma completo;

VHS na primeira hora, estimada pelo método Western; PCR (mg/dL, com titulacao).

b) Exames imunológicos:

Fator reumatoide: medido usando técnica de aglutinacao em látex em lamina para fator AR biótico, para determinacao qualitativa do FR no soro.

c) Óxido nítrico sérico:

A determinacao do NO foi realizada utilizando o ELISA (R & D Systems, Inc., Minneapolis, EUA). Este ensaio determina as concentrares de NO com base na conversao enzimá-tica de nitrato para nitrito pela acao da nitrato-redutase. Um passo preliminar de desproteinizacao foi realizado utilizando o método de ultrafiltracao; o filtro usado foi o Centristart 1, for-necido pelo grupo Vivascience Sartorius (www.sartorius.com). A reacao é seguida pela deteccao colorimétrica de nitrito como produto corante anazo da reacao de Griess.7

III. Exames radiológicos:

Foram realizadas radiografias simples das maos e dos punhos para pontuacao do dano radiológico, utilizando o método de Sharpe.8

Análise estatística

Os dados coletados foram codificados, tabulados e analisados estatisticamente utilizando o programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences), versao 17.0. Foi efetuada a descricao das variáveis qualitativas utilizando número e porcentagem.

O teste do qui-quadrado foi aplicado para comparaçâo das variáveis qualitativas. Utilizou-se o teste exato de Fisher em lugar do teste de qui-quadrado quando se esperava < 5 células. Empregou-se o teste t nao pareado para comparar dois grupos independentes no que diz respeito às variáveis quan-titativas. O coeficiente de correlacao de Spearman e Person foi utilizado para classificar as diferentes variáveis entre si, positiva ou inversamente. O valor de p representou o nível de significância, em que p > 0,05 foi considerado como nao significativo (NS), p < 0,05 como significativo (S) e p < 0,001 como altamente significativo (AS).

Resultados

No Grupo I havia 23 mulheres e 19 homens. A idade variava de 27 a 63 anos, com média de 48,78 ± 12,41 anos e duracao média da doenca de 5,48 ±6,63 anos. No Grupo II havia 21 mulheres e 17 homens. A idade variava de 28 e 65 anos, com média de 44,10 ±10,54 anos e duracao média da doenca de 6,59 ± 5,81 anos. Nao houve diferencia significativa entre os dois grupos com relacao a género, idade ou duracao da doenca.

A fadiga e a rigidez matinal foram significativamente mais frequentes no grupo I versus II (p < 0,001). Os pacientes do Grupo I também tiveram valores de VHS e PCR significativamente maiores que os pacientes do grupo II (p < 0,001) (tabela 1). Houve diferenca significativa entre os grupos I e II com relacao ao índice de Sharpe (tabela 2).

Ao comparar o nível de NO entre os trés grupos, foram detectados níveis significativamente mais elevados entre os pacientes com AR em comparacao com os controles. Os níveis mais elevados foram obtidos entre os pacientes com AR com doenca ativa (Grupo I) (tabela 3).

A comparacao entre o nível sérico de NO e vários parámetros da doenca no Grupo I mostrou uma correlacao positiva significativa (p < 0,05) com a rigidez matinal, artrite e contagem

Tabela 2 - Comparacao entre os Grupos I e II com relacao ao índice radiográfico de Sharpe

Índice de Sharpe Grupo I Grupo II p

n % n %

0 2 5 3 8 < 0,05

1 4 10 16 42 < 0,001

2 6 14 11 29 < 0,01

3 18 43 5 13 < 0,001

4 10 23 2 5 < 0,001

5 2 5 0 0 < 0,01

Tabela 3 - Comparacao entre os Grupos I, II e III, com relacao ao nível sérico de NO

NO sérico Grupo I Grupo II Grupo III Valor p

Média ±DP 82,38 ±20,46 35,53 ±7,15 14,25 ±4,09 <0,001

Níveis significativamente mais elevados de NO foram detectados entre os pacientes com AR, em comparacao com os controles, e os níveis mais elevados foram obtidos entre os pacientes com AR e com doenca ativa (Grupo I).

de plaquetas, e uma correlacao positiva altamente significativa (p < 0,001) com a atividade da doenca, VHS e PCR (tabela 4). Por outro lado, nao foi demonstrada correlato positiva com o índice de Sharpe das radiografias das maos (p < 0,05) no Grupo I (fig. 1). Nao foi possível detectar qualquer correlato significativa entre o NO e o índice de Sharpe das radiografias das maos.

Discussao

A inflama^ao e a lesao tecidual relacionadas com o estresse oxidativo tem sido implicadas na patogenese da AR. O estresse oxidativo e a diminuido do estado antioxidante sao as marcas registradas em pacientes com AR, como tem sido observado nos últimos anos.9 A lesao tecidual dependente do NO tem sido implicada em uma variedade de doenccas reumáticas, incluindo a AR.10

r = 0,432 Valor p = 0,005*

140 -120 100 -

0 1 2 3 4 5 6

Radiografía da mao

Figura 1 - Correlacao entre o nível sérico de NO e o índice de Sharpe das radiografias das maos no Grupo I. O NO demonstrou uma correlacao positiva significativa com o índice de Sharpe nas radiografias das maos (p < 0,05).

O presente estudo avaliou o nível de NO como um marcador do estresse oxidativo em pacientes com AR e sua relacao com a atividade da doenca. O estudo recrutou 80 pacientes com AR: 42 pacientes com doenca ativa (Grupo I) e 38 com doencca inativa (Grupo II).

Os pacientes com doencca ativa queixavam-se significativamente mais (p < 0,001) de rigidez matinal e de fadiga em comparacao com aqueles com doenca inativa. Isso provavel-mente se deve ao fato de que as manifestares clínicas, como por exemplo a rigidez matinal, tem sido há muito tempo asso-ciadas com a atividade da doenca em pacientes com AR, e por isso espera-se que valores significativamente mais elevados sejam obtidos em pacientes com artrite reumatoide ativa.11

No presente estudo, tanto a VHS quanto a PCR estavam significativamente mais elevadas no grupo com a doencca ativa (p < 0,001). Embora a PCR parecía ser o melhor teste para a mediccao da fase aguda, deve-se considerar que a VHS é sensível a imunoglobulinas e ao FR, de modo que este último parámetro é melhor para medir a gravidade geral (em comparacao com a PCR), embora seja uma medida nao tao boa para a inflamacao.12 Em um estudo que teve por objetivo ava-liar a utilidade clínica das medidas de PCR e VHS na avaliacao de pacientes com AR, verificou-se que esses dois indicadores foram preditores significativos da contagem de articulares inchadas (p < 0,001 para ambas as variáveis).13

Neste estudo, a comparacao entre os níveis séricos de NO nos tres grupos revelou uma diferencia altamente significativa (p < 0,001), sendo que foram encontrados níveis significativamente mais elevados entre pacientes com AR em comparacao com os controles; e foram obtidos níveis ainda mais elevados em pacientes com AR ativa (82,38 ± 20,46) em comparacao com o grupo com a doenca inativa (35,53 ±7,15). Os níveis séricos de NO no Grupo I revelaram uma correlacao positiva significativa com a rigidez matinal (r = 0,45), artrite (r = 0,43) e contagem de plaquetas (r= 0,46) e encontrou-se uma correlacao positiva altamente significativa entre o NO e a VHS (r = 0,83) e a PCR (r = 0,76), bem como com o DAS (r = 0,84).

Na comparacao entre os dois grupos no que se refere ao dano radiológico avaliado pelo índice de Sharpe, foi observada uma diferenca significativa entre os dois grupos (p < 0,001). Os níveis de NO mostraram uma correlacao positiva significativa (r = 0,43) com o índice de Sharpe das radiografias das maos apenas no Grupo I, mas nao foi possível detectar correlacao

Tabela 4 - Correlacao entre o nível sérico de NO e vários

parámetros da doenca no Grupo I

Variável r Valor p

Idade 0,231 >0,05

Duracíao da doencía -0,252 >0,05

Rigidez matinal 0,453 < 0,05

Artritea 0,432 < 0,05

Plaquetas 0,458 < 0,05

VHS 0,832 < 0,001

PCR 0,763 < 0,001

Atividade da doencía 0,846 < 0,001

VHS, velocidade de hemossedimentafáo; PCR, proteína C-reativa.

O NO demonstrou uma correlacíao positiva sig nificativa (p < 0,05)

com a rigidez matinal, a artrite e a contagem de plaquetas, e uma

correlacíao positiva altamente si nificativa (p < 0,001) com a ativi-

dade da doencía, a VHS e a PCR.

a Contagem de 28 articulares sensíveis e/ou inchadas.

entre o NO e o índice de Sharpe das radiografias das maos no Grupo II. Alguns estudos demonstraram uma relacao longitudinal entre a atividade da doenca e o quadro radiográfico.14 Um estudo concluiu que o nível de atividade da doenca, bem como a duracao da remissao, afetam a progressao subsequente do dano radiográfico em pacientes com AR.15 Por conseguinte, tendo em vista que a atividade da doenca pode ser um dos produtores de lesao nas articulaçбes e de progressao radiográfica na AR, seria de se esperar que, uma vez que o NO está correlacionado com a atividade da doenca, também se correlacionaria com os danos radiográficos em pacientes com a doenca ativa, como foi detectado no presente estudo. Contrastando com isso, outros estudos concluíram que, apesar da melhora clínica e da remissao em pacientes com AR ativa, a progressao radiográfica continua ao longo do tempo, em razao do processo inflamatório subjacente.16

Dentro da mesma linha de nosso estudo, várias pesquisas demonstraram um aumento do nível sérico de NO em pacientes com AR, em comparacao com grupos controle.17,18 Um estudo sugeriu que a produçao de nitrato e nitrito é aumentada em pacientes com AR, em comparacao com indivíduos saudáveis.4

Foi demonstrado que o NO regula as funcбes dos linfóci-tos T em condi^es fisiológicas; mas a superproduçao de NO pode contribuir para a disfunçao dessas células. O aumento na produçao de NO em pacientes com AR pode ser decorrente do aumento da atividade da NO sintase.19

Do mesmo modo, foi detectada uma correlacao significativa entre as concentracбes séricas de nitratos e o número de articulaçбes sensíveis, número de articulaçбes inchadas, pontuaçao DAS e nível de PCR.20 Os resultados sugerem que estes achados podem servir como parâmetros confiáveis da atividade da doenca em pacientes com RA.

Embora tenha sido sugerido que as espécies reativas de nitrogênio sao produzidas no interior das articulaçбes inflamadas de pacientes com AR e que os níveis se correlacionam diretamente com a atividade da doenca,21 vários estudos con-cluíram que o nível de NO nao se correlaciona com a VHS e nem com a PCR, e que havia uma correlacao nao significativa entre os níveis séricos de cada uma das espécies de nitrogê-nio e a duracao da doenca ou VHS, como um marcador da atividade da doenca.18,22

O estresse oxidativo produzido em uma articulaçao inflamada pode contribuir para o fenómeno autoimune e para a destruiçao do tecido conjuntivo em pacientes com AR. A produçao de NO e de prostaglandina E2 a partir dos con-drócitos articulares provavelmente contribui para a destruiçao da cartilagem observada em casos de artrite.23 No presente estudo, foi detectada uma correlaçao positiva significativa entre o NO sérico e o quadro radiológico em ambos os grupos com AR, sugerindo um papel para o NO nao só na atividade da doença, mas também nos danos articulares.

No presente estudo transversal realizado em uma coorte de pacientes egípcios com AR, o NO nao só foi detectado em níveis significativamente mais elevados em pacientes com AR ativa, mas esse indicador também estava significativamente correlacionado com vários parâmetros e com a atividade da doença. O estudo também incluiu uma avaliaçao radiológica das maos utilizando o índice de Sharpe, que também apre-sentou uma correlaçao significativa com os níveis de NO.

No entanto, principalmente devido à limitaçao imposta pelo seu modelo transversal, os resultados do estudo talvez este-jam demonstrando um efeito causal do NO, ou simplesmente podem estar refletindo o estado inflamatório da atividade da doença.

Finalmente, pode-se concluir que há um aumento do nível sérico de NO em pacientes com AR, e que o nível de NO se correlaciona significativamente com a atividade da doença, bem como com o status radiológico das articulacбes. Isto poderia sugerir o envolvimento de radicais livres nao só no processo inflamatório da AR, mas também na destruiçao das articulaçбes. Novos protocolos terapêuticos, baseados na correçao dos níveis de estresse oxidativo, poderao se revelar eficazes em restringir a progressao da doença, com limitaçao das deformidades.

Conflito de interesses

Os autores declaram nao haver conflitos de interesses. refer ê ncias

1. Li H, Wan A. Apoptosis of Rheumatoid Arthritis Fibroblast-Like Synoviocytes: Possible Roles of Nitric Oxide and the Thioredoxin 1. Mediators Inflamm. 2013:953462. Epub 2013 Apr 3.

2. Vasanthi PNalini G, Rajasekhar G. Status of Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. Int J Rheum Dis. 2009;12:29-33.

3. Phillips DC, Dias HK, Kitas GD, Griffiths HR. Aberrant reactive oxygen and nitrogen species generation in RA: causes and consequences for immune function, cell survival

and therapeutic intervention. Antioxid Redox Signal. 2010;12:743-85.

4. Ersoy Y,Ozerol E, Baysal O, Temel I, MacWalter RS, Meral U, et al. Serum nitrate and nitrite levels in patients with rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, and osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2002;61:76-8.

5. Aletaha D, Neogi T, Silman A, Funovits J, Felson DT, Bingham CO 3rd, et al. Rheumatoid arthritis classification criteria: an American College of Rheumatology/European League against Rheumatism collaborative initiative. Ann Rheum Dis. 2010 Sep;69:1580-8.

6. Aletaha D, Smolen J. The Simplified Disease Activity Index and the Clinical Disease Activity Index: a review of usefulness and validity in rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol. 2005;23 5 Suppl 39:S100-8.

7. Green LC, Wagner DA, Glogowski J, Skipper PL, Wishnok JS, Tannenbaum SR. Analysis of nitrate, nitrite, and [15N] nitrate in biological fluids. Anal Biochem. 1982 Oct;126:131-8.

8. Sharp JT, Young DY, Bluhm GB, Brook A, Brower AC, Corbett M, et al. How many joints in hands and wrists should be included in a score of radiologic abnormalities used to assess rheumatoid arthritis? Arthritis Rheum. 1985;28:1326-35.

9. Ajay K, Pranshi M, Neelima S. Study of non-enzymatic antioxidant and lipid peroxide levels in rheumatoid arthritis. UJMD. 2012;1:10-3.

10. Nagy G, Koncz A, Telarico T, Fernandez D, Ersek B, Buzas E, et al. Central role of nitric oxide in pathogenesis of rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 2010;12:210.

11. Tamas MM, Felea I, Rednic S. How much difference does the age at onset make in early arthritis patients? Comparison between the ACR 1987 and the ACR/EULAR 2010 classification

criteria for rheumatoid arthritis at the time of diagnosis. Rheumatol Int. 2013 Nov;33:2881-4.

12. Wells G, Becker JC, TengJ, Dougados M, Schiff M, Smolen J. Validation of the 28-joint Disease Activity Score (DAS28) and European League Against Rheumatism response criteria based on C-reactive protein against disease progression in patients with rheumatoid arthritis, and comparison with the DAS28 based on erythrocyte sedimentation rate. Ann Rheum Dis. 2009;68:954-60.

13. Cynthia S, Mahboob U, Eric L. Which Measure of Inflammation to Use? A Comparison of Erythrocyte Sedimentation Rate and C-Reactive Protein Measurements from Randomized Clinical Trials of Golimumab in Rheumatoid Arthritis. J Rheumatol. 2010;36:1606-10.

14. Landewe R, Van der Heijde D. Radiographic progression in rheumatoid arthritis. Clin Exp Rheumatol. 2005;23 Suppl. 39:S63-8.

15. Aletaha D, Funovits J, Breedveld FC, Sharp J, Segurado O, Smolen JS. Rheumatoid arthritis joint progression in sustained remission is determined by disease activity levels proceeding the period of radiographi assessment. Arthritis Rheum. 2009;60:1242-9.

16. Markatseli TE, Voulgari PV, Alamanos Y Drosos AA. Prognostic Factors of Radiological Damage in Rheumatoid Arthritis: A 10-year Retrospective Study. J Rheumatol. 2010;38:44-52.

17. Savas G, Arzu S, Eda C. Nitric oxide and superoxide dismutase in rheumatoid arthritis: Correlation with disease activity. Turkish Journal of Family Medicine and Primary Care. 2012;6:1.

18. Aida A, Mohamed A. Serum Protein Carbonyl Content, Total Thiol and Nitric Oxide in Patients with Rheumatoid Arthritis. Journal of American Science. 2011;7:683-6.

19. Maki-Petaja KM, Cheriyan J, Booth AD, Hall FC, Brown J, Wallace SM, et al. Inducible nitric oxide synthase activity is increased in patients with rheumatoid arthritis and contributes to endothelial dysfunction. Int J Cardiol. 2008;129:399-405.

20. Onur O, Akinci AS, Akbiyik F, Unsal I. Elevated levels of nitrate in rheumatoid arthritis. Rheumatol Int. 2001;20:

154-8.

21. Khan F, Siddiqui A. Prevalence of anti-3-nitrotyrosine antibodies in the joint synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis, osteoarthritis and systemic lupus erythematosus. Clin Chim Acta. 2006;370:100-7.

22. Marwan S, Samir A, Khalid S. Serum nitric oxide and peroxynitrite levels in adult sero-positive rheumatoid arthritis treated with disease modifying antirheumatic rugs: a preliminary report. Turk J Med Sci. 2010;40:191-7.

23. Amin A, Attur M, Abramson S. Cox2, NO and cartilage damage and repair. Curr Opin Rheumatol. 2000;2:447-53.