Scholarly article on topic 'Patogenicidad de especies de Fusarium asociadas a la pudrición basal del ajo en el centro norte de México'

Patogenicidad de especies de Fusarium asociadas a la pudrición basal del ajo en el centro norte de México Academic research paper on "Sociology"

CC BY-NC-ND
0
0
Share paper
Academic journal
Revista Argentina de Microbiología
OECD Field of science
Keywords
{Ajo / " Fusarium spp." / Patogenicidad / "Identificación molecular" / Garlic / " Fusarium spp." / Pathogenicity / "Molecular identification"}

Abstract of research paper on Sociology, author of scientific article — Juan C. Delgado-Ortiz, Yisa M. Ochoa-Fuentes, Ernesto Cerna-Chávez, Mariana Beltrán-Beache, Raúl Rodríguez-Guerra, et al.

Resumen El ajo en México es uno de los cultivos de hortalizas más rentables, más del 83% de esta superficie es aportada por los estados de Zacatecas, Guanajuato, Sonora, Puebla, Baja California y Aguascalientes. La pudrición basal ocasionada por Fusarium spp. se encuentra ampliamente distribuida a nivel mundial; esta enfermedad se ha convertido en una limitante en zonas productoras de cebolla y ajo, no solo en México, sino también en otros países, En México, se ha informado la presencia de Fusarium oxysporum en plantas en Guanajuato y en semillas de ajo en Aguascalientes. En el estado de Morelos se ha reportado la presencia de Fusarium culmorum en cultivares de cebolla. Asimismo, en Aguascalientes se tienen antecedentes de otras especies como Fusarium proliferatum, Fusarium verticillioides, Fusarium solani y Fusarium acuminatum. Para este trabajo se planteó como objetivo identificar las especies de Fusarium encontradas en los estados de Zacatecas, Guanajuato y Aguascalientes, y evaluar su patogenicidad. Se realizaron recolectas de plantas con síntomas de la enfermedad en los estados antes mencionados. De los muestreos realizados se identificaron las especies F. oxysporum, F. proliferatum, F. verticillioides, F. solani y F. acuminatum; las cepas de Aguascalientes identificadas como AGS1A (F. oxysporum), AGS1B (F. oxysporum) y AGSY-10 (F. acuminatum) fueron las que presentaron bajo condiciones de invernadero un mayor índice de severidad. Abstract Garlic in Mexico is one of the most profitable vegetable crops, grown in almost 5,451ha; out of which more than 83% are located in Zacatecas, Guanajuato, Sonora, Puebla, Baja California and Aguascalientes. Blossom-end rot caused by Fusarium spp is widely distributed worldwide and has been a limiting factor in onion and garlic production regions, not only in Mexico but also in other countries. The presence of Fusarium oxysporum has been reported in Guanajuato and Aguascalientes. Fusarium culmorum has been reported in onion cultivars of Morelos; and Fusarium proliferatum, Fusarium verticillioides, Fusarium solani and Fusarium acuminatum have been previously reported in Aguascalientes. The goal of this work was identifying the Fusarium species found in Zacatecas, Guanajuato and Aguascalientes, to assess their pathogenicity. Plants with disease symptoms were collected from hereinabove mentioned States. The samples resulted in the identification of: F. oxysporum, F. proliferatum, F. verticillioides, F. solani and F. acuminatum species; out of which Aguascalientes AGS1A (F. oxysporum), AGS1B (F. oxysporum) and AGSY-10 (F. acuminatum) strains showed higher severity under greenhouse conditions.

Academic research paper on topic "Patogenicidad de especies de Fusarium asociadas a la pudrición basal del ajo en el centro norte de México"

Rev Argent Microbiol. 2016;48(3):222-228

REVISTA ARGENTINA DE

MICROBIOLOGÍA

www.elsevier.es/ram

ORIGINAL

Patogenicidad de especies de Fusarium asociadas a la pudrición basal del ajo en el centro norte de México

Juan C. Delgado-Ortiza, Yisa M. Ochoa-Fuentesa*, Ernesto Cerna-Chávez Mariana Beltrán-Beachea, Raúl Rodríguez-Guerrab, Luis A. Aguirre-Uribea y Otilio Vázquez-Martínezc

CrossMark

a Departamento de Parasitología, Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, Saltillo, Coahuila, México b Campo Experimental General Terán, INIFAP, General Terán, Nuevo León, México

c Centro de Ciencias Agropecuarias, Universidad Autónoma de Aguascalientes, Jesús María, Aguascalientes, México

Recibido el 6 de noviembre de 2015; aceptado el 12 de abril de 2016 Disponible en Internet el 31 de agosto de 2016

PALABRAS CLAVE

Fusarium spp.; Patogenicidad; Identificación molecular

Resumen El ajo en México es uno de los cultivos de hortalizas más rentables, más del 83% de esta superficie es aportada por los estados de Zacatecas, Guanajuato, Sonora, Puebla, Baja California y Aguascalientes.

La pudrición basal ocasionada por Fusarium spp. se encuentra ampliamente distribuida a nivel mundial; esta enfermedad se ha convertido en una limitante en zonas productoras de cebolla y ajo, no solo en México, sino también en otros países, En México, se ha informado la presencia de Fusarium oxysporum en plantas en Guanajuato y en semillas de ajo en Aguascalientes. En el estado de Morelos se ha reportado la presencia de Fusarium culmorum en cultivares de cebolla. Asimismo, en Aguascalientes se tienen antecedentes de otras especies como Fusarium proliferatum, Fusarium verticillioides, Fusarium solani y Fusarium acuminatum. Para este trabajo se planteó como objetivo identificar las especies de Fusarium encontradas en los estados de Zacatecas, Guanajuato y Aguascalientes, y evaluar su patogenicidad. Se realizaron recolectas de plantas con síntomas de la enfermedad en los estados antes mencionados. De los muestreos realizados se identificaron las especies F. oxysporum, F. proliferatum, F. verticillioides, F. solani y F. acuminatum; las cepas de Aguascalientes identificadas como AGS1A (F. oxysporum), AGS1B (F. oxysporum) y AGSY-10 (F. acuminatum) fueron las que presentaron bajo condiciones de invernadero un mayor índice de severidad.

© 2016 Asociación Argentina de Microbiología. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Este es un artículo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

* Autor para correspondencia. Correo electrónico: yisa8a@yahoo.com.mx (Y.M. Ochoa-Fuentes).

http://dx.doi.Org/10.1016/j.ram.2016.04.003

0325-7541/© 2016 Asociación Argentina de Microbiología. Publicado por Elsevier España, S.L.U. Este es un artículo Open Access bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Fusarium species associated with basal rot of garlic in North Central Mexico and its pathogenicity

Abstract Garlic in Mexico is one of the most profitable vegetable crops, grown in almost 5,451 ha; out of which more than 83% are located in Zacatecas, Guanajuato, Sonora, Puebla, Baja California and Aguascalientes.

Blossom-end rot caused by Fusarium spp is widely distributed worldwide and has been a limiting factor in onion and garlic production regions, not only in Mexico but also in other countries. The presence of Fusarium oxysporum has been reported in Guanajuato and Aguascalientes. Fusarium culmorum has been reported in onion cultivars of Morelos; and Fusarium proliferatum, Fusarium verticillioides, Fusarium solani and Fusarium acuminatum have been previously reported in Aguascalientes. The goal of this work was identifying the Fusarium species found in Zacatecas, Guanajuato and Aguascalientes, to assess their pathogenicity. Plants with disease symptoms were collected from hereinabove mentioned States. The samples resulted in the identification of: F. oxysporum, F. proliferatum, F. verticillioides, F. solani and F. acuminatum species; out of which Aguascalientes AGS1A (F. oxysporum), AGS1B (E oxysporum) and AGSY-10 (E acuminatum) strains showed higher severity under greenhouse conditions. © 2016 Asociación Argentina de Microbiología. Published by Elsevier España, S.L.U. This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

KEYWORDS

Garlic;

Fusarium spp.; Pathogenicity; Molecular identification

Introducción

El ajo en México es uno de los cultivos de hortalizas más rentables, existen aproximadamente 5.451 de ha cultivadas; más del 83% de esta superficie es aportada por los estados de Zacatecas, Guanajuato, Sonora, Puebla, Baja California y Aguascalientes23. México se ubica como el vigésimo segundo país productor de ajo10.

Entre las principales enfermedades de origen fúngico que causan daños de importancia económica al cultivo se destacan la pudrición blanca (ocasionada por Sclerotium cepivorum Berk); sin embargo, también se presentan enfermedades causadas por cepas de Botrytis spp., Sclerotium rolsfii, Penicillium spp. y Fusarium spp.27; esta última ha tenido mayor incidencia durante los últimos añnos26.

Fusarium es un género que cuenta con especies patogénicas y especializadas, responsables de enfermedades en cultivos específicos14. La pudrición basal ocasionada por Fusarium spp. se encuentra ampliamente distribuida a nivel mundial y se ha convertido en una limitante en zonas productoras de cebolla y ajo13. Los muestreos en parcelas cultivadas con ajo perla y ajo morado permitieron concluir que Fusarium spp. fue el agente causal de la pudrición basal. Esta afección se manifiesta con coloraciones café en las puntas de las hojas, las que se van tornando rojizas o púrpuras cuando el patógeno logra extenderse hasta la base de las hojas. También puede haber enanismo en la planta, los bulbos esponjosos y tallos de consistencia blanda y raíces con coloraciones de color café a rojo26. Algunas de las sintomatologías antes mencionadas han sido reportadas en plantas infectadas con Fusarium oxyspo-rum, Fusarium proliferatum, Fusarium culmorum, Fusarium solani y Fusarium acuminatum en Estados Unidos, Turquía, Venezuela, Uruguay, Países Bajos, Japón, Serbia, Espana y México3,4,6,9,11,15,17,19,21,25. La pudrición basal del bulbo de cebolla (agente causal: F. oxysporum f. sp. cepae) y del

ajo (agente causal: F. culmorum)24 pueden manifestarse en forma de danos por damping-off o una reducción en la germinación de la semilla6; los daños causados pueden llevar a una merma de rendimientos del 40%24.

En muestreos de semillas de ajo originarias de Aguascalientes, México, Ochoa et al.19 identificaron morfológica y molecularmente —mediante ITS— F. oxysporum, F. solani, F. acuminatum y F. verticillioides, mas no se evaluó la patogenicidad de las cepas encontradas. Para este trabajo se plantearon como objetivos identificar las especies de Fusarium halladas en los estados de Zacatecas, Guanajuato y Aguascalientes, así como evaluar la patogenicidad de cada una de las especies encontradas.

Materiales y métodos Muestreo

La recolecta del material se realizó en los estados de Zacatecas, Guanajuato y Aguascalientes; en este último se realizó en el mes de enero del 2013 y en los 2 primeros en marzo de ese ano (tabla 1). Se recolectaron de cada una de las parcelas 12 plantas con síntomas de la enfermedad y 3 aparentemente sanas, para descartar que existieran plantas asintomáticas.

Aislamiento

Se realizaron pequeñnos cortes de la zona de avance de la infección, donde el patógeno podría encontrarse en activo desarrollo (raíces con tejido con coloración café o rojiza), el material muestreado se desinfectó con hipoclorito sodio al 1% durante 3 min, se enjuagó en 3 ocasiones con agua destilada estéril y se sembró en placas de Petri con medio PDA (Bioxon®) adicionado con ácido láctico (200 ^l de ácido

Tabla 1 Origen de las muestras

Número de localidad Estado Municipio Coordenadas

Norte Este

1 Zacatecas Veta Grande 22° 53' 383 102° 25' 304

2 Zacatecas Guadalupe 1 22° 56' 526 102° 21' 593

3 Zacatecas Guadalupe 2 23° 00' 057 102° 19' 060

4 Zacatecas Villa de Cos 1 23° 00' 556 102° 18' 384

5 Zacatecas Villa de Cos 2 23° 10' 657 102° 25' 627

6 Zacatecas Panuco 23° 02' 626 102° 27' 085

7 Zacatecas Fresnillo 23° 08' 913 102° 43' 126

8 Zacatecas Calera 1 23° 06' 413 102° 39' 503

9 Zacatecas Calera 2 22° 57' 725 102° 43' 405

10 Zacatecas Gral. Enrique Estrada 23° 02' 770 102° 42' 256

11 Guanajuato Comonfot 20° 42' 232 100° 49' 981

12 Guanajuato Celaya 20° 34' 839 100° 49' 400

13 Guanajuato Cortazar 1 20° 26' 972 101° 00' 732

14 Guanajuato Cortazar 2 20° 27' 871 100° 59' 220

15 Aguascalientes Rincón de Romos 22° 14' 071 102° 17' 135

16 Aguascalientes Rincón de Romos 22° 12' 098 102° 15' 977

17 Aguascalientes Rincón de Romos 22° 13' 235 102° 15' 439

láctico al 85%). Las placas fueron incubadas a 27 ±2° C durante 7 días. Los cultivos puros en PDA fueron incubados a 27±2°C.

Identificación a nivel de género

Esta se basó en la estructura y la composición de las conidias, las fiálides y las clamidosporas descriptas en las claves de Barnett y Hunter2, y Nelson et al.18.

Obtención de cultivos monoconidiales

Luego de la identificación a nivel de género, se elaboraron cultivos monoconidiales con una suspensión de conidios, que fue dispersada en placas con medio PDA. A las 24 h, 4 conidios germinados fueron transferidos a PDA. Las colonias monoconidiales fueron transferidas al medio de cultivo Spezieller Nahrstoffmmarmer agar (SNA, 1 g de KH2PO4, 1 g de KNO3, 0,5g de MgSO47H2O, 0,5g de KCl, 0,2g de glucosa, 0,2g de sacarosa y 20g de agar en un litro de agua destilada) y mantenidas para su conservación bajo las condiciones antes mencionadas. A partir de estas colonias se llevó a cabo la identificación de especies.

Identificación a nivel de especie

Se realizó a partir de las colonias obtenidas en las placas de SNA mediante la observación de sus características microscópicas. La identificación se basó en lo indicado por el manual de laboratorio de Leslie y Summerell14.

Identificación molecular

La extracción de ADN se realizó mediante el método de Doyle y Doyle modificado8. Se raspó el micelio de Fusarium spp. de una caja de Petri con medio de cultivo papa dextrosa agar. Se pesaron 0,2 g de micelio, que se

maceraron con una varilla esmerilada con 500 ^l de regulador de extracción (Tris-HCl pH 8, 100 mM; EDTA pH 8,5, 50 mM; NaCl 50 mM y SDS 2%), se agitó en un vórtex durante 30 s y se dejó reposar en hielo 15 min. Se agregaron luego 500 ^l de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) y se agitó en un vórtex; posteriormente se centrifugó a 12.000rpm durante 15 min, se recuperó la fase acuosa en un tubo nuevo y se le adicionó el mismo volumen de isopropanol, se dejó reposar por 15 min en hielo para posteriormente centrifugar a 12.000rpm durante 10min. Se desechó el sobrenadante y se recuperó la pastilla, la cual fue resuspendida en 50 ^l de agua desionizada estéril. Se agregaron 10 ^l de ARNasa y se incubó a 37°C durante 1 h. Finalmente se determinó la concentración de ADN y se diluyó hasta obtener la concentración adecuada para la reacción de PCR.

Se utilizaron iniciadores específicos para cada una de las especies de Fusarium identificadas morfológicamente; los iniciadores para F. oxysporum fueron CLOX1 (5-GCAAAGCATCAGACCACTATAACTC-3) y CLOX2 (5-TTGTCAGTAACTGGACGTTGGTACT-3)12, para F. acuminatum fueron FACF (5 - GGGATATCGGGCCTCA-3 ) y FACR (5 -GGGATATCGGCAAGATCG-3 )1, para F. verticillioides se emplearon los iniciadores VERT 1 y VERT2 (5 -GTCAGAATC-CATGCCAGAACG-3' y 5-CACCCGCAGCAATCCATCAG-3', respectivamente)6, mientras que para F. proliferatum se empleó PRO1 (5-CTTTCCGCCAAGTTTCTTC-3)22 y en el caso de F. solani se emplearon los primers TEF-Fs4f (5 -ATCG-GCCACGTCGACTCT-3 ) y TEF-Fs4r (5 -GGCGTCTGTTGATT-GTTAGC-3 ), bajo las condiciones señaladas por Mohammad et al.16. Las PCR se realizaron en el termociclador modelo MaxyGen (Axygen®/EE. UU.).

Pruebas de patogenicidad en invernadero

La producción de plantas en invernadero se llevó acabó en el Centro de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Autónoma de Aguascalientes; semillas de ajo variedad Ensenada

Tabla 2 Cepas empleadas en la prueba de patogenicidad en invernadero

Estado Cepaa Especie

Zacatecas ZAC 1A F. proliferatum

Zacatecas ZAC21B F proliferatum

Zacatecas ZAC54A F proliferatum

Zacatecas ZAC 124A F verticillioides

Zacatecas ZAC75 A-2 F verticillioides

Zacatecas ZAC 43B F verticillioides

Zacatecas ZAC13A F oxysporum

Zacatecas ZAC54B F oxysporum

Zacatecas ZAC66C F oxysporum

Zacatecas ZAC52A F solani

Zacatecas ZAC23A F acuminatum

Zacatecas ZAC119A F acuminatum

Guanajuato GTO 13 A-1 F proliferatum

Guanajuato GTO 10 A-2 F proliferatum

Guanajuato GTO 1 B-1 F proliferatum

Guanajuato GTO 1A F verticillioides

Guanajuato GTO 10B F verticillioides

Guanajuato GTO 58A F verticillioides

Guanajuato GTO 1D F oxysporum

Guanajuato GTO6B F oxysporum

Guanajuato GTO 2D F oxysporum

Guanajuato GTO 37B F solani

Guanajuato GTO 12A F solani

Guanajuato GTO 54A F solani

Aguascalientes AGS 4 C F proliferatum

Aguascalientes AGS 9 A-1 F proliferatum

Aguascalientes AGS 8A F proliferatum

Aguascalientes AGS 31 B-1 F verticillioides

Aguascalientes AGS 32 B-2 F verticillioides

Aguascalientes AGS 8B F verticillioides

Aguascalientes AGS 1A F oxysporum

Aguascalientes AGS 4A F oxysporum

Aguascalientes AGS 1B F oxysporum

Aguascalientes AGS 8 C-1 F solani

Aguascalientes AGS Y-10b F acuminatum

a Clave usada para denominar a las cepas aisladas, las 3 primeras letras identifican el estado, el número identifica a la muestra de la cual se aisló y la siguiente letra (o letra-número) designa la cepa por caja Petri después de la purificación. b Cepa proporcionada por la Dra. Yisa María Ochoa Fuentes, de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro.

fueron desinfectadas con hipoclorito de sodio (3%) durante 3min y se enjuagaron 3 veces con agua destilada estéril. Luego fueron sembradas en bolsas con sustrato estéril, 4 plantas por tratamiento. Los tratamientos consistieron en 12 cepas del estado de Guanajuato, 10 del estado de Aguascalientes, 12 del estado de Zacatecas y un testigo que fue inoculado con agua destilada estéril bajo condiciones controladas; al estudio se incluyó la cepa AGS Y-10, la cual fue aislada en semillas de ajo procedentes del estado de Aguascalientes por la Dra. Yisa María Ochoa Fuentes de la Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro, la cual fue usada para comparar la patogenicidad de la cepa ZAC119A. Estas cepas fueron seleccionadas aleatoriamente para representar a cada una de las especies encontradas en los 3

estados de México en estudio. En la tabla 2 se muestra una lista de las cepas empleadas.

Preparación del inóculo

La preparación del inóculo se realizó de la siguiente manera: al micelio de las diferentes cepas se les agregó 50 ml de agua destilada estéril y se licuó, posteriormente se ajustó la suspensión de conidias a una concentración de 106 conidias/ml, esto se realizó con la ayuda de un hematocitómetro.

Inoculación de las plantas

La inoculación se llevó a cabo cuando las plantas presentaron 3 hojas completamente abiertas, cada planta fue tratada alrededor del cuello (la zona donde cambia de color blanco a verde) y dicho inóculo fue cubierto con sustrato estéril, al testigo se le adicionó agua destilada estéril.

Se evaluó la reacción cada 24 h después de la inoculación, con la finalidad de describir la severidad de la enfermedad se recurrió a la escala utilizada por Velásquez y Medina26, la cual consistió en 3 puntos: punto 1, planta sana; punto 3, planta con hojas amarillas o rojas, puntas púrpuras y/o dano en el cuello de la planta, y punto 5, planta muerta. Los resultados fueron sujetos a un análisis de varianza para determinar los efectos de los aislados y se realizó una comparación de medias de Tukey al 0,05.

Resultados

Identificación morfológica

De los muestras se pudieron recuperar 147 cepas del género Fusarium, entre las cuales se logró identificar cinco especies: 1) F. acuminatum, que presentó macroconidias grandes y delgadas con 3 septos; su célula apical era cónica, estrecha y elongada, la célula basal con forma de pie, pero no tan prominente como las de otras especies relacionadas, además presentó cadenas largas o grupos de clamidosporas; 2) F. oxysporum, esta presentó micelio de coloración blanco-violeta o coloraciones en el agar violetas, rosadas, amarillas, marrones y, en algunos casos, no mostró pigmentación en el agar. Conidios en falsas cabezas, con monofialides cortas, abundantes microconidias elípticas compuestas por una o 2 células, macroconidias con la célula apical cónica y en algunas ocasiones se observó una especie de gancho, y la célula basal en forma de pie o en ocasiones pobremente desarrollada y la célula apical redondeada y de 3 a 4 septos, con clamidosporas de textura lisa; 3) F. solani exhibió coloraciones blancas, crema y café en el micelio y pigmentaciones de color crema, rosadas y marrón, conidios en falsas cabezas, con monofialides largas, microconidias ovaladas a elípticas constituidas por una o 2 células, macro-conidias con la célula basal y la célula apical redondeadas, de 3 a 4 septos; también se observó la presencia de clami-dosporas con apariencia lisa o rugosa en forma individual o en pares; 4) F. proliferatum presentó micelio en una gama de colores del blanco-violeta, con coloraciones moradas en el agar, además mostró largas cadenas de conidias en mono-fialides y polifialides, las microconidias exhibieron forma

~600 pb

500 pb

1.000 pb

500 pb

~700 pb _ 500 pb d • «•»* t Jkt

~600 pb ■ _ , , — —

~300 pb— «r i

Figura 1 Productos de PCR para la identificación de Fusarium spp. Marcador de peso molecular de 100-3.000 pb. a) F. proliferatum. b) F. verticillioides. c) F solani. d) F. oxysporum. e) F. acuminatum.

producto de ~600 pb; 50 cepas con los iniciadores PRO1 y PRO2 para F. proliferatum, con un producto de ~600 pb; 33 cepas se identificaron como F. verticillioides con los iniciadores VERT 1 y VERT 2, con un producto de amplificación de entre 900-1.000 pb; 2 cepas se alinearon con los iniciadores FACF y FACR para F. acuminatum, dando como resultado un producto ~300 pb, y 10 cepas se identificaron como F. solani, con un producto ~700 pb (fig. 1).

Pruebas de patogenicidad

El análisis de varianza de los índices de severidad indicó que existe diferencia significativa (0,0439), con un coeficiente de variación de 51,56; las cepas AGS1A (F. oxysporum), AGS1B (F. oxysporum) y AGSY-10 (F. acuminatum) fueron las que manifestaron mayor severidad (tabla 3), mientras que el resto de las cepas evaluadas no mostraron diferencia significativa, a excepción del testigo, que presentó

de mazo con la base aplanada y en algunas ocasiones se presentaron en forma de pera; además de presentarse en falsas cabezas, y 5) F. verticillioides, cuyo micelio presentó coloraciones blancas con amarillo y/o moradas; con pigmentaciones amarrillas o moradas en el agar, microconidias en falsas cabezas y en largas cadenas de conidias en monofiali-des, en ocasiones se observó la presencia de hifas hinchadas con una apariencia similar a las clamidosporas2,7,14,19.

La especie encontrada con mayor frecuencia fue F. oxysporum (36,05%), le siguió F. proliferatum (34,01%), F. verticillioides y F. solani, con 22,45% y 6,12%; respectivamente, y la menos frecuente fue F. acuminatum con un 1,36%.

Identificación molecular

De las 147 cepas obtenidas, 53 se alinearon con los iniciadores CLOX 1 y CLOX 2 para F. oxysporum; estas dieron un

Tabla 3 Comparación de medias del índice de severidad de

los aislados de Fusarium spp

Cepa Media Agrupamientoa

AGS1A 3,5 a

AGS1B 3,5 a

AGSY-10 3,5 a

ZAC75A-2 3,0 a b

AGS4A 3,0 a b

GTO12A 3,0 a b

GTO6B 3,0 a b

AGS8B 3,0 a b

GTO1B-1 3,0 a b

GTO1D 3,0 a b

AGS31B-1 3,0 a b

ZAC52A 3,0 a b

ZAC23A 3,0 a b

ZAC54B 3,0 a b

GT010B 2,25 a b

GTO13A-1 2,25 a b

AGS8C-1 2,25 a b

GTO10A-2 2,25 a b

GTO2D 2,25 a b

GTO37B 2,25 a b

ZAC21B 2,25 a b

AGS4C 2,25 a b

ZAC66C 2,25 a b

GTO1A 2,25 a b

ZAC199A 2,25 a b

AGS9A-1 2,25 a b

ZAC54A 2,25 a b

GTO58A 2,25 a b

ZAC124A 2,25 a b

AGS8A 1,5 a b

ZAC43B 1,5 a b

ZAC1A 1,5 a b

GTO54A 1,5 a b

ZAC13A 1,5 a b

AGS32B-2 0,75 a b

TEST 0 a b

a Medias de índices de severidad con letra igual indican ausen-

cia de diferencia significativa (Tukey 0,05).

diferencia significativa con el resto de las plantas en la prueba. Las primeras plantas en mostrar síntomas característicos de la enfermedad fueron las inoculadas con las cepas GTO54A (F: solani) y AGS1B (F oxysporum); cabe mencionar que esta última fue una de las cepas que expresó mayor patogenicidad.

Discusión

Identificación morfológica

Las especies obtenidas en este estudio habían sido reportadas anteriormente por Ochoa et al.19,20 en semillas de ajo en el estado de Aguascalientes.

Identificación molecular

La identificación morfológica fue ratificada mediante PCR empleando primers específicos para cada especie. Se obtuvieron las bandas esperadas con los pesos descritos en la literatura12-16-22, a excepción de F. verticillioides, de la cual se obtuvieron bandas de ~1.000 pb, lo que resulta superior a lo reportado6, y de F. acuminatum, de la cual se obtuvieron bandas de ~300 pb, tamaño inferior a lo esperado de acuerdo con lo que informaba la literatura1.

La frecuencia con la que fueron encontradas las diferentes especies de Fusarium coincide con lo comunicado por Dissanayake et al.6 y Rabiei-Motlagh et al.22, quienes hallaron a F. oxysporum como el agente de mayor incidencia en cultivos de cebolla en Irán y Japón, además estos autores informaron la presencia de F. solani, F. proliferatum y F. verticillioides. Sin embargo, Stankovic et al.25 documentan que fue F. proliferatum la especie predominante en cultivos de ajo y cebolla en Serbia, y que con menor frecuencia aislaron F. oxysporum, F. solani, F. acuminatum y F. equiseti. Montes et al.17 comunicaron la presencia de F. culmorum en cultivares de cebolla en el estado de Morelos, México; cabe recalcar que esta especie no fue encontrada en los muestreos realizados en este trabajo.

Pruebas de patogenicidad

Todas las plantas inoculadas comenzaron a mostrar síntomas a los 15 días de la inoculación, como coloraciones café iniciando por la punta de las hojas, las cuales comenzaron a tornarse rojizas a moradas; en el punto de inoculación algunas plantas mostraron una coloración morada y los tallos presentaron consistencia blanda5,26.

La comparación de medias de los índices de severidad otorgados en las pruebas de patogenicidad demuestran que hay variación patogénica entre los diversos aislados de la misma especie y dentro de la misma localidad, lo cual puede estar relacionado con la capacidad de la especie para generar los síntomas de la enfermedad de acuerdo a la variedad del hospedero25. Esto concuerda con lo reportado por Dissanayake et al.6, quienes senalan a algunos aislados de F. oxysporum como los agentes con mayor índice de severidad. Estos autores a su vez reportan aislados de F. oxysporum, F. verticillioides y Я solani con menor capacidad patogénica.

Los resultados de la investigación senñalan que AGSY-10 fue una de las cepas que mostró mayor patogenicidad, siendo esta cepa más patogénica que la cepa aislada en este estudio (ZAC119A); cabe mencionar que Stankovic et al.25 aislaron de cebolla y ajo las siguientes especies: F proliferatum, F oxysporum, F. solani y F acuminatum, pero solo evaluaron la patogenicidad de las cepas identificadas como F. proliferatum.

En este trabajo se identificaron morfológicamente y molecularmente las especies F oxysporum, F. proliferatum, F. verticillioides, F. solani y F acuminatum, esta última se halló solo en los estados de Zacatecas y Aguascalientes. Las cepas que mostraron mayor patogenicidad fueron AGS1A y AGS1B, pertenecientes a la especie F. oxysporum.

Responsabilidades éticas

Protección de personas y animales. Los autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.

Confidencialidad de los datos. Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Derecho a la privacidad y consentimiento informado. Los

autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Bibliografía

1. Abedi M, Kazem S. Morphological and molecular identification of Fusarium head blight isolates from wheat in north of Iran. Australian Journal Crop Science. 2012;6:1356-61.

2. Barnett HL, Hunter BB. Illustrated genera of imperfect fungi. Saint Paul, Minnesota: APS Press; 1998.

3. Bayraktar H, Türkkan M, Sara F. Characterization of Fusarium oxysporum f.sp. cepae from onion in Turkey based on vegetative compatibility and rDNA RFLP analysis. J Phytopathol. 2010;158:691-7.

4. Cramer CS. Breeding and genetics of Fusarium basal rot resistance in onion. Euphytica. 2000;115:159-66.

5. Delgadillo SF. Enfermedades: descripción y tratamiento. En: Heredia E, Delgadillo F, editores. El ajo en México. Origen, mejoramiento genético, tecnología de producción. Libro Técnico Núm. 3. León, Gto., México: Campo Experimental Bajío-INIFAP; 2000. p. 102-71.

6. Dissanayake MLMC, Kashima R, Tanaka S, Ito S. Pathogenic variation and molecular characterization of Fusarium species isolated from wilted Welsh onion in Japan. J Gen Plant Pathol. 2009;75:37-45.

7. Domsch KH, Gams W, Anderson H. Compendium of soil fungi. New York. 1980. p. 1-2.

8. Doyle JJ, Doyle JL. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 1990;12:13-5.

9. Dugan FM, Hellier BC, Lupien SL. First report of Fusarium proliferatum causing rot of garlic bulbs in North America. Plant Pathology. 2003;52:426.

10. FAOSTAT [Faostat.fao.org]. Producción mundial de ajo. Organización de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentación. [actualizado 2013; consultado 10 Nov 2013]. Disponible en: http://faostat.fao.org.

11. Galván GA, Koning CFS, Koopman WJM, Burger K, González PH, Waalwijk C, Kik C, Scholten OE. Genetic variation among Fusarium isolates from onion, and resistance to Fusarium basal rot in related Allium species. European Journal of Plant Pathology. 2008;121:499-512.

12. Gómez E. Caracterización de cepas toxigénicas del género Fusarium mediante técnicas de biología molecular. Tesis

doctoral ingeniero agrónomo 2008. ANLIS «Rosa María Montes Estellés» y Universidad Politécnica de Valencia.

13. Kiehr M, Delhey R. Fusarium oxysporum y F. proliferatum como causa de podredumbre basal y muerte de plántulas de cebolla, en el sur argentino. XII Congreso Latinoamericano-XXVIII Congreso Argentino de Horticultura, Argentina, 2005, p. HV13.Ciudad General Roca, Argentina.

14. Leslie JF, Summerell BA. Species descriptions. En: Leslie JF, Summerell BA, editores. The Fusarium laboratory manual. 11st edition Iowa: Blackwell Publishing; 2006, 388-121.

15. Martínez GE, Albarracín N, Arcia A, Subero L, Albarracín M. Pudrición basal del ajo causado por Fusarium oxysporum. Agronomía Tropical. 1995;46:265-73.

16. Mohammad A, Shilpi C, Zaidi NW, Rayar JK, Variar M, Singh US. Development of specific primers for genus Fusarium and F. solani using rDNA sub-unit and transcription elongation factor (TEF-1«) gene. Afri J Biotechnol. 2012;11:444-7.

17. Montes R, Nava RA, Flores HE, Mundo M. Hongos y nematodos en raíces y bulbos de cebolla (Allium capa L.) en el estado de Morelos, México. Rev Mex Fitopatol. 2003;21:300-4.

18. Nelson P Toussoun T, Marasas W. Fusarium species, an ilustred manual for identification. Universidad de Pensilvania; 1983. p. 40.

19. Ochoa YM, Cerna E, Gallegos G, Landeros J, Delgado JC, Hernández S, Rodríguez R, Olalde V. Identificación de especies de Fusarium en semilla de ajo, en Aguascalientes, México. Rev Mex Micol. 2012;36:27-31.

20. Ochoa YM, Delgado JC, Cerna E, Hernández FD, Flores A, Gallegos G, Vázquez O, Rodríguez R. The first report of Fusarium proliferatum causing garlic bulb rots in Mexico. Afr J Agric Res. 2013;8:570-3.

21. Palmero D, Cara M, Nosir W, Gálvez L, Cruz A, Woodward S, González MT, Tello JC. Fusarium proliferatum isolated from garlic in Spain: Identification, toxigenic potential and pathogenicity on related Allium species. Phytopathol Mediterr. 2012;51: 207-18.

22. Rabiei E, Falahati M, Rouhani H, Jafarpour B, Jahanbakhsh V. Root diseases of onion caused by some root colonizing fungi in Northeast of Iran. American-Eurasian J Agric and Environ Sci. 2010;7:484-91.

23. SAGARPA-SIAP. Secretaria de Agricultura, ganadería, desarrollo rural, pesca y alimentación. Sistema de información agroalimentaria y pesquera. Estadística pecuaria [actualizado 1 Ago 2012; consultado 10 Nov 2013]. Disponible en: http://www.siap.sagarpa.gob.mx/.

24. Schwartz HF, Mohan K. Compendium of oion and garlic diseases. San Diego, California: Academic Press; 1995. p. 54.

25. Stankovic S, Levic J, Petrovic T Logrieco A, Moretti A. Pathogenicity and mycotoxin production by Fusarium proliferatum isolated from onion and garlic in Serbia. Eur J Plant Pathol. 2007;118:165-72.

26. Velásquez R, Medina MM. Características vegetativas y susceptibilidad de variedades de ajo (Allium sativum L.) infectadas por Fusarium spp. Rev Mex Fitopatol. 2004;22:435-8.

27. Velásquez R, Medina MM. Pudrición por Fusarium. En: Velásquez R, Medina MM, editores. Guía para conocer y manejar las enfermedades más comunes de la raíz de ajo en Aguasca-lientes y Zacatecas. Folleto para productores No 34. Campo Experimental Pabellón-CIRNOC-INIFAP. Aguascalientes, Aguas-calientes, México, 2004.