Scholarly article on topic 'Új módszertani lehetőségek és ezek alkalmazása a hormonális rendszer daganatainak genetikai kivizsgálásában'

Új módszertani lehetőségek és ezek alkalmazása a hormonális rendszer daganatainak genetikai kivizsgálásában Academic research paper on "Biological sciences"

0
0
Share paper
Academic journal
Orvosi Hetilap
OECD Field of science
Keywords
{""}

Academic research paper on topic "Új módszertani lehetőségek és ezek alkalmazása a hormonális rendszer daganatainak genetikai kivizsgálásában"

Uj modszertani lehetosegek es ezek alkalmazäsa a hormonälis rendszer daganatainak genetikai kivizsgäläsäban

Patocs Attila dr.1, 2' 3 ■ Liko Istvän dr.1 ■ Butz Henriett dr.4 Baghy Kornelia dr.2, 5 ■ Räcz Käroly dr.2, 4

1Magyar Tudomänyos Akademia-Semmelweis Egyetem, „Lendület" Örökletes Endokrin Daganatok

Kutatocsoport, Budapest 2Bionikai Innoväcios Központ Nonprofit Kft., Budapest 3Semmelweis Egyetem, Altalänos Orvostudomänyi Kar, Laboratoriumi Medicina Intezet, Budapest 4Magyar Tudomänyos Akademia-Semmelweis Egyetem, Molekuläris Medicina Kutatocsoport, Budapest 5Semmelweis Egyetem, Altalänos Orvostudomänyi Kar, I. Patologiai es Kiserleti Räkkutato Intezet, Budapest

Az utobbi evek rohamos technologiai fejlodese a molekuläris biologiai vizsgalomodszerek területen lehetove tette, hogy a daganatos betegsegekhez tarsulo genetikai rendellenessegek kimutatasa a hagyomanyos egy elteres-egy gen leptekrol gencsoportokra vagy akar a teljes genomra helyezodjenek at. Daganatos betegsegekben e vizsgalatoknak oriasi a jelentosege. Szamos olyan korforma ismert, amelyben a daganatok csaladon belüli halmozodasa figyelheto meg, illetve szamos olyan elteres valt ismertte, amely specialis terapia indikalasat vonja maga utan. Bar a mintaforras es minta-elokeszites alapvetoen eltero a csirasejtes es szomatikus elteresek vizsgalatakor, a technologiai hatter ugyan-az. A klinikai genetikai munka soran a vizsgalatok celja azon betegek azonositasa, akikben egy adott csirasejtes elteres hordozasa daganatos korkep nagy kockazataval jar együtt, mig kialakult daganat eseteben a daganatszövet genetikai vizsgalataval kimutathatok azok a genhibak, amelyek terapias beavatkozasok celja lehet. Jelen rövid összefoglaloban a szerzok attekintik az uj generacios szekvenalas nyujtotta lehetosegeket a hormonalis rendszer daganatainak genetikai kivizsgalasaban, kiterve a szakmai ajanlasokra, a vizsgalatok soran felmerülo technikai es etikai kerdesekre. Orv. Hetil., 2015, 756(51), 2063-2069.

Kulcsszavak: phaeochromocytoma, paraganglioma, mutacio, uj generacios szekvenalas

Novel methods and their applicability in the evaluation of genetical background of tumours of the endocrine system

The technical developments leading to revolution in clinical genetic testing offer new approaches for patients with cancer. From one mutation or one gene approach the scale of genetic testing moved to whole exome or whole genome scale. It is well known that many tumours are genetically determined ans they are part of familial tumour syndromes. In addition, some mutations indicate specific molecular targeted therapies. Although sampling and sample preparation are different for testing germline and somatic mutations, the technical background of the analysis is the same. The aim of clinical genetic testing is to identify patients who are carriers of disease-causing mutations or to test tumour tissue for the presence of genetic alterations which may be targets for therapeutic approaches. In this review the authors summarize novel possibilities offered by next-generation sequencing in clinical genetic testing of patients with endocrine tumours. In addition, the authors review recent guidelines on technical and ethical issues related to these novel methods.

Keywords: pheochromocytoma, paraganglioma, mutation, next-generation sequencing

Patocs, A., Liko, I., Butz, H., Baghy, K., Racz, K. [Novel methods and their applicability in the evaluation of genetical background of tumours of the endocrine system]. Orv. Hetil., 2015, 756(51), 2063-2069.

(Beerkezett: 2015. oktober 5.; elfogadva: 2015. oktober 29.)

Roviditesek

Gb = gigabazis; MEN = multiplex endokrin neoplasia; MB = megabazis; NF1 = neurofibromatosis 1-es tipusa; NF1 = neurofibromatosis 1-es tipusaert felelos gen; NGS = uj generacios szekvenalas; PCR = polimeraz lancreakcio; PRKAR1A = cAMP-fuggo feherjekinaz-1 a-alegyseget szabalyozo gen; PTPN11 = nem receptor tipusu feherjetirozin-foszfataz-11-et kodolo gen; RET = rearrenged during transfection gen; SDHA = szukcinat-dehidrogenaz alfa-alegyseget kodolo gen; SDHAF2 = szukcinat-dehidrogenaz-komplexhez asszocialt fe-herje; SDHB = szukcinat-dehidrogenaz B alegyseget kodolo gen; SDHC = szukcinat-dehidrogenaz C alegyseget kodolo gen; SDHD = szukcinat-dehidrogenaz D alegyseget kodolo gen; TMEM127 = transzmembran protein 127; VHL = von Hippel-Lindau-szindroma

A molekularis genetikai modszerek rohamos fejlodese es terjedese a klinikai genetikai diagnosztika atalakulasahoz vezet. Korabban a genetikai vizsgalatok soran a monogenes korkepek eseteben altalaban egy gen vagy a leg-gyakoribb mutaciok vizsgalatat vegeztek el polimeraz lancreakciot (PCR) követo bidirekcionalis Sanger-szek-venalassal. Azonban mar korabban is ismert volt, hogy szamos esetben (akar örökletes daganatos betegsegek-ben is) több gen hibaja allhat a daganatos betegseg hat-tereben [1]. Az emlo- vagy vastagbelrak hattereben is több különbözo gen patogenetikai szerepet igazoltak, igy a diagnosztikus genetikai vizsgalatoknak ezeknek a geneknek a vizsgalatara is ki kell terjedniük. A hagyoma-nyos modszerekkel ezek a vizsgalatok hatalmas költseget jelentenek, es a mintaveteltol az eredmeny kiadasaig eltelt ido nagyon gyakran több honapnal hosszabb.

A hormonalis rendszer daganatai közül szamos tumor tarsul ugynevezett monogenes tumorszindromakhoz (1. tMAzat). Ezeknek a szindromaknak nagyon eltero a klinikai megjelenese; szamos daganat, mint peldaul a mellekpajzsmirigy joindulatu tumora vagy a mellekvese-velobol kiindulo phaeochromocytoma, több szindroma reszjelensege lehet [2, 3, 4]. Ezeknek a szindromaknak a masik fontos tulajdonsaga az, hogy meg ugyanazt a mu-taciot hordozo csaladokban is nagyon eltero a daganatok penetranciaja. Ezek a jellegzetessegek hozzajarulnak ah-hoz, hogy a klinikai diagnozis felallitasa gyakran nehez, es meg sporadikusnak tuno esetekben is gondolni kell örökletes betegsegre.

A leggyakrabban felismert es vizsgalt endokrin tu-morszindromak a multiplex endokrin neoplasia 1-es (MEN-1) es 2-es tipusa (MEN-2), von Hippel-Lindau-szindroma, neurofibromatosis 1-es tipusa, örökletes phaeochromocytoma/paraganglioma szindromak, Cow-den-kor es a Carney-komplex. Közös jellemzojük az autoszomalis dominans öröklesmenet, ami az utodok-ban 50%-os valoszinuseggel vezet a betegseget okozo elteres transzmissziojahoz [4].

1. tablazat I A hormonalis rendszer daganataival tarsulö örökletes tumor-| szindrömak klinikai jellemzöi

Daganatok es egyeb Betegseget okozo

elteresek gen

Mellekpajzsmirigy- MEN-1

adenoma

Hypophysisdaganat Enteropancreaticus neuroendokrin daganat Medullaris pajzsmirigyrak RET Phaeochromocytoma Mellekpajzsmirigy-adenoma

Haemangioblastoma VHL Vilagos sejtes veserak Phaeochromocytoma Pancreas szigetsejtes daganat

Vese- es pancreascisztak_

Paraganglioma/ Phaeochromocytoma SDHA, SDHAF2, Phaeochro- Fej-nyak paraganglioma SDHB, SDHC,

mocytoma SDHD, FH, MAX,

_TMEM127

Neurofibromatosis Neurofibromak NF1

1-es tipusa (bor es bel)

Cafe-au-lait foltok

Neurofibromak

Lisch-csomok

(iris neurofibroma)

Opticus glioma,

Központi idegrendszeri

daganatok

Phaeochromocytoma Tuberosus sclerosis Angiomyolipoma TSC1, TSC2

Hypopigmentalt maculak Vesecisztak Hamartomak Ritkan

phaeochromocytoma Carney-komplex Primer pigmentalt PRKAR1A

nodularis mellekvesekereg-hyperplasia, Sziv- es bormyxomak, acromegalia

_Emlo- es heredaganatok_

Li-Fraumeni- Mellekvesekereg- TP53

szindroma carcinoma, Emlo- es

heredaganatok, csonttumorok, sarcoma,

_agydaganat_

Cowden/BRR- Fibrocystas emlobetegseg PTEN szindroma Lipomatosis

Follicularis pajzsmirigy-carcinoma

Endometrium carcinoma Trichilemmoma

BRR-szindroma: Bannayan-Riley-Ruvalcaba-szindroma; LKB1/ STK11: szerin, treonin-kinaz 11-et kodolo gen; NF1: neurofibromatosis 1-es tipusaert felelos gen; PRKAR1A: cAMP-függo feherjekinaz-1 a-alegyseget szabalyozo gen; PTPN11: 11-es nem receptor tipusu fe-herje-tirozin-foszfatazt kodolo gen; SDH: szukcinat-dehidrogenaz al-egysegeit kodolo genek; TP53: p53 tumorszuppresszor gen; TSC1, TSC2: hamartint es tuberint kodolo genek; VHL: von Hippel-Lindau-betegseg

Multiplex endokrin

neoplasia

1-es tipus

Multiplex endokrin

neoplasia

2-es tipus

Von Hippel-Lindau-szindroma

Örökletes endokrin tumorszindromak

A MEN-1 szindroma fo komponensei a mellekpajzsmi-rigy-adenoma vagy -hyperplasia, hasnyalmirigy neuroen-dokrin daganat es hypophysisdaganat. A betegseget a MEN-1 tumorszuppresszor gen örökletes mutacioi okozzak. A betegsegokozo genhibak lehetnek pontmu-taciok, deletiok es inszerciok, amelyek a gen teljes szaka-szan elofordulhatnak. Specifikus genotipus-fenotipus összefügges nem ismert.

A MEN-1 szindroma egyik fo összetevoje, a mellek-pajzsmirigy-adenoma egyeb örökletes szindromakban is elofordulhat (MEN-2 szindroma, familiaris hypercalcae-mias hypocalciuria [FHH], familiaris izolalt hyperpara-thyreosis [FIHPT], mellekpajzsmirigy-adenoma-allka-pocstumor szindroma). Ezek a korkepek szinten autoszomalis dominans öröklodesmenetet követnek. Ezert mellekpajzsmirigy-adenoma eseten több gen vizs-galata is indokolt lehet (MEN-2 szindroma gyanuja eseten RET, FHH es FHIP gyanuja eseten CaSR es mellek-pajzsmirigy-adenoma-allkapocstumor szindroma gyanuja eseten HPRT2 gen vizsgalat) [4].

MEN-2 szindromaban medullaris pajzsmirigyrak, phaeochromocytoma es hyperparathyreosis fordul elo. A klinikai megjelenes alapjan több klinikai altipus ismert. Ezek közül kiemelendo a rendkivül sulyos lefolyast mu-tato MEN-2B szindroma, amelyben a fent ismertetett tumorokhoz jellegzetes külso jelek (marfanoid alkat, ajak-, szaj- es szemhejnyalkahartya-neuromak) tarsulnak. A betegsegert a RET protoonkogen aktivalo mutacioi a felelosek. Ebben a korkepben a RET protoonkogen-mu-taciok igazolasanak nemcsak a diagnozis felallitasaban, hanem a betegseg prognozisanak a megiteleseben is fon-tos szerepe van. Szoros genotipus-fenotipus összefügge-sek ismertek, amelyek meghatarozzak a mutaciot hordo-zokban a preventiv pajzsmirigy-eltavolitas idopontjat. Latszolag sporadikus medullaris pajzsmirigyrakos esetek 1-7%-aban mutathato ki RET-mutacio [4].

A MEN-2 szindroma különösen fontos komponense a phaeochromocytoma. A phaeochromocytoma hattere-ben napjainkig nem kevesebb, mint 15 gen csirasejtes mutaciojat igazoltak (2. tMAzat). Örökletes phaeochro-mocytoma/paraganglioma szindromaban a szukcinat-dehidrogenaz enzim (SDH) alegysegeit kodolo genek (SDHA, SDHB, SDHC, SDHD, SDHAF2) mellett az elmult nehany evben azonositott genek (FH, KIF1B, PHD2, MAX, TMEM127 es MDH2) is szerepet jatsza-nak. A klinikai gyakorlatban phaeochromocytoma, illet-ve paraganglioma eseten a leggyakrabban a RET, VHL, SDHB es SDHD genek vizsgalatat vegzik [1, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16], de indokolt esetben a többi gen vizsgalata is szükseges lehet. A diagnozis meg-allapitasat termeszetesen az egyes szindromak klinikai es biokemiai jellegzetessegei is segithetik. A genspecifikus molekularis genetikai vizsgalatok mellett foglalt allast az Amerikai Endokrin Tarsasag es ajanlasaban fenotipusori-entalt algoritmus alkalmazasara tett javaslatot [2]. Az

2. táblázat I Phaeochromocytomák és paragangliomák hátterében álló örök-| letes genetikai eltérések és felfedezésük ideje

Szindroma Gén Azonosításának ideje

Neurofibromatosis 1-es tipus NF1 1990

von Hippel-Lindau-szindroma VHL 1993

MEN-2 RET 1994

PGL1 SDHD 2000

PGL4 SDHB 2000

PGL3 SDHC 2001

Pheo-, neuroblastoma, tüdocarcinoma KIFlß 2008

Paraganglioma, erythrocytosis PHD2 2008

PGL2 SDHAF2 2010

Pheo-, paraganglioma TMEM127 2010

Pheo-, paraganglioma SDHA 2011

Pheo-, paraganglioma MAX 2011

Pheoganglioma FH 2014

Pheoganglioma MDH2 2015

ajánlás szerint MEN-2 és a VHL-szindróma kizárását ko-vetoen a szukcinát-dehidrogenáz enzim alegységeit kó-doló SDHB, SDHC és SDHD gének csírasejtes mutáció-inak vizsgálata javasolt. SDH génmutációk a látszólag sporadikus esetek 10-15%-ában is elofordulhatnak. Az SDHB, SDHC és SDHD gének egyideju vizsgálata cél-szeru, de a fenotípus alapján prioritás is megállapítható. Így például fontos megfigyelés, hogy SDHC-mutációt mind ez idáig csak fej/nyak paragangliomák esetében igazoltak. Malignitás gyanúja esetén elsoként az SDHB gén vizsgálata javasolt [2].

A kovetkezokben a phaeochromocytoma/paragangli-oma szindrómát okozó 15 gén egyideju vizsgálatára alkalmas új generációs szekvenálási eljárást mutatjuk be és elemezzük ennek elonyeit, illetve hátrányait.

Az új generációs szekvenálási technológia háttere

Az új generációs szekvenálási technikák (next-generation sequencing - NGS) kozos jellemzoje, hogy egy mérés so-rán lehetoség van tobb ezer (millió) külonbozo DNS-minta párhuzamos vizsgálatára, ami nagy áteresztoké-pességet (high-throughput) jelent. Felhasználási területe rendkívül szerteágazó, az alapkutatásoktól egészen a ru-tindiagnosztikáig terjed [17]. Az elvárások azonban ko-zosek, és teljesítésük csak tobb szakterület (laboratóriu-mi szakorvos, informatikus, biológus) együttes munkája esetén lehet sikeres.

Minta-elokészítés és konyvtárkészítés

Az NGS-alapú mérés kiindulási anyaga itt sem más, mint a hagyományos molekuláris biológiai módszerek esetén:

jo minoségu és elegendo mennyiségu nukleinsavra van szûkség. A kiindulâsi DNS-nek épnek és tôredezéstol mentesnek kell lennie. Ez annak ellenére feltétel, hogy az NGS-mérések kezdeti lépésében végzendo konyvtarké-szités sorân a DNS porlasztâsât végzik annak érdekében, hogy a platformfüggo adapterszekvenciâk bekôtése (li-gâlâsa) megtôrténjen. Platformtol függoen a következo lépés az adapterszekvenciâkkal kiegészitett DNS-mole-kulâk sokszorozâsa. Ez tôrténhet PCR-rel vagy hibridi-zâcioval [17]. A Life Technologies/Thermo Fisher (Carlsbad, CA, Amerikai Egyesült Allamok) platform esetén a SOLID, PGM és Ion Proton rendszerek alkal-mazâsakor még egy köztes lépésre, az ugynevezett nick transzlâciora is szûkség van [18]. Mindezek miatt nem kerülhetok el teljes mértékben a célszekvenciâkbol eredo hibâk (PCR-primerek eltéro affinitâsa a különbözo szek-venciâkhoz, magas GC-tartalom, hosszu repetitiv szek-venciâk). Szintén problémât jelenthetnek a genom kopiaszâm-vâltozâsokat mutato régioi, valamint a célgé-nekkel nagyfoku homologiât mutato pszeudogének je-lenléte. Ezek biztos vizsgâlata ugynevezett âthidalo PCR-termékek szekvenâlâsâval lehetséges.

Amplikonszekvenâlâs esetén a könyvtârkészités sorân a célszekvenciâkra specifikus primereket és probâkat ter-veznek. A könyvtâr nagysâgât a szekvenâlâshoz rendel-kezésre âllo eszköz hatârozza meg. Jelenleg a génpane-lek âtlagosan 8-160 génig terjednek, attol függoen, hogy melyik gyârto készülékén történik a mérés. A lefe-dettség, igy a célgénszakaszokrol szârmazo informâcio nagy, akâr többezres lefedettség is elérheto, foleg kisebb panelek esetében. Ugyanakkor a PCR sorân felmerül a duplikâcio lehetosége, amikor a PCR-rel létrehozott duplikâtumok nem különithetok el az eredeti célszek-vencia amplifikâlâsâtol [17]. Hâtrânyt jelent az is, hogy azokrol a génekrol kapunk csak informâciot, amelyek a panelünkben szerepelnek. Ezért példâul olyan betegsé-gek esetében, amelyeknél uj gének szerepe merül fel, uj panelek tervezése szükséges.

NGS-en alapulo szekvendlds alapelvei és gyakorlati jellemzoi

Jelen összefoglalo terjedelmi korlâtai nem teszik leheto-vé, hogy részletesen ismertessük az összes forgalomban levo, NGS-t alkalmazo technologiât, ezért csak a klinikai diagnosztikâban mâr kiprobâlt modszereket mutatjuk be.

Illumina szekvenalas

A fenyvtârkészités alapja a kiindulâsi DNS darabolâsa/ fragmentâlâsa, amihez egy timinel tulnyulo véggel ren-delkezo adapter DNS-t ligâlnak. A ligâlt DNS-t egyszâ-lusitjâk a mintât egy szekvenâlo cellâba (flow cell) viszik fel. A mérés és a gyârto készMékeinek kapacitâsât az is meghatârozza, hogy hâny ilyen cellât tartalmaznak. A fobb kész^ékek közül a miSeq egyet, a HiSeq2500 és a 2014-tol elérheto NextSeq500 és a HiSeq X Ten kettot tartalmaznak. Ez utobbi készülék a legnagyobb kapacitâ-

su, elsodleges felhasznâlâsi területe a populâciôs szintu genomikai vizsgâlatok végzése és mind közepes (40 Gb kimeno adat) mind nagy teljesitmény (120 Gb kimeno adat) elérésére képes. Ennek a készûléknek a nem titkolt célja az, hogy egy humân genom szekvenâlâsa 1000 USD alâ kerüljön. Az Illumina készûlékek mukôdési alapja az adapterrel komplementer primerek, és ezek fel-hasznâlâsa az ugynevezett hid-amplifikâciô (bridge amplification) sorân. Maga a szekvenâlâs szintézissel tôrté-nik, a templâthoz egy primert ligâlnak, majd a reakciôhoz egyszerre adjâk hozzâ a 4 különbözo fluoreszcens jelölt nukleotidokat. A szekvenâlâs sorân beépûlt nukleotidok jelét CCD kamerâval vagy LED alapon detektâljâk [19, 20].

Life Technologies/Thermo Fisher PGM és Ion Proton szekvenâlâs

A môdszer félvezeto technolôgiât hasznâl és a beépûlo nukleotidok sorân felszabadulô protonokat detektâlja

[18]. A szekvenâlandô templâtokat gyöngyökön készitik el emulziôs PCR segitségével. Ebben a viz-olaj keverék-ben a szekvenâlâshoz szûkséges összes reagens jelen van. A templâtként szolgâlô gyöngyöket a protont érzékelo lyukakba töltik, majd a szekvenâlâsi reakciô sorân a beépûlo nukleotidokkal arânyos mennyiségu protonfelsza-badulâs jön létre, amit a beépitett ph-szenzor detektâl

[19]. Az Illumina és Ion Torrent jelfeldolgozâsâban a hibâk arânya hasonlô, körülbelül 0,1%, bâr 3,5%-ot is el-érhet azoknâl a templâtoknâl, ahol homopolimerek for-dulnak elo. Ezek tipikusan a sok adenint tartalmazô szekvenciâk [21].

Roche 454 szekvenâlâs

Kifejezetten a klinikai genetikai diagnosztikai alkalmazâst tartotta szem elott a Roche, amikor bevezette a piroszek-venâlâson alapulô technolôgiâjât. A korâbban ismertetett eljârâsokhoz képest abban is elorelépést jelentett, hogy a GS Junior elnevezésu készülék kisebb léptéku, egyedileg tervezett génlistâk szekvenâlâsât is lehetové tette. Hason-lôan az Illuminâhoz, a szekvenâlâs szintézissel tôrténik egy speciâlis, mikrotiter platen, amelyben a lyukâtméro olyan, hogy abba egyszerre csak egy gyöngy fér be. Eze-ken a gyöngyökön mennek végbe a szekvenâlâsi reakci-ôk, amelyek sorân a polimerâz meghosszabbitja a DNS-szâlat a platekhez ciklikusan hozzâadott fluoreszcens jelet kibocsâtô nukleotidokkal. A beépités sorân fotonemisz-sziô jön létre, amit CCD-kamerâval detektâlnak [22].

Érdekességként jegyezzük meg, hogy klinikai alkalma-zâs sorân az elso genetikai diagnôzishoz, amit teljes humân exom szekvenâlâsâval âllitottak fel, hibrid môdszert (a tonyvtârkészitéshez a Nimblegen/Roche reagenst, mig a szekvenâlâshoz Illumina készMéket) hasznâltak [23]. Ez elorevetitette azt a lehetoséget, hogy bâr minden gyârtô igyekszik sajât termékpalettâjât kialakitani, a fânyvtârkészitéshez vagy a célzott szekvenâlâshoz szük-séges primerek tervezése sorân egyéni megoldâsok és ezek ötvözése is elképzelheto.

Adatok értékelése, bioinformatika

Sikeres szekvenâlâst követoen az adatok elemzése jelenti a valodi kihivâst, hiszen a modszertol fûggoen akâr 100 Gb méretu adatâllomâny kezelése és értelmezése szûksé-ges. Természetesen minden gyârtonak van sajât adatérté-kelo programcsomagja, és a terület dinamikus fejlodése révén szâmos ingyenesen elérheto algoritmus is rendel-kezésre âll. Ahhoz, hogy a napi klinikai genetikai diag-nosztikâban elterjedjen az NGS-alapu metodikâk hasz-nâlata, a bioinformatikai munkafolyamatok klinikai validâlâsa is szûkséges. Ezt fogalmazta meg az Europai Humângenetikai Târsasâg ajânlâsa is, ami kimondja, hogy a bioinformatikai elemzés eredményének értékelé-se a klinikai genetikus, humângenetikus, laboratoriumi szakember és az adott betegségben jârtas klinikus orvos közös feladata [24].

A feldolgozâs sorân elso lépés az adatok minoségének elemzése, majd a kônyvtârkészités sorân hasznâlt adap-terszekvenciâk levâgâsa. Ezt követi a megmaradt szek-venciâk referenciagenomra tôrténo illesztése. Célzott szekvenâlâs sorân a referenciagenombol a célgének koor-dinâtâit veszik alapul, mig exom vagy teljes genom szek-venâlâsakor a teljes genomot. Az illesztéshez komoly szâmitâstechnikai hâttér szûkséges (adatok târolâsa, az illesztések sorân âtmeneti târolâs és szâmitokapacitâs).

A szekvenciâk illesztését követoen minden egyes bâ-zishoz megkapjuk azt, hogy valojâban hâny olvasatban (readben) van jelen az adott mérésben, ezt hivjuk lefe-dettségnek (covarage). Az irodalomban még nem alakult ki konszenzus annak eldöntésére, hogy mekkora az a mi-nimâlis lefedettség, ami szûkséges egy szekvenâlâsi ered-mény elfogadâsâhoz. Csirasejtes DNS szekvenâlâsakor âltalâban minimum 10-15 readet tekintenek elfogadha-tonak. Heterozigota mutâciok/variânsok esetében felté-tel az is, hogy a két allél közötti readmegoszlâs az ideâlis 50-50%-tol csak akkor fogadhato el, ha a kevésbé lefe-dett allél esetén is minimum 20%-os elofordulâs volt ki-mutathato [18].

A szekvenâlâsi readek illesztése utân a következo feladat azoknak az eltéréseknek a meghatârozâsa, amelyeknek po-tenciâlis szerepe lehet a betegség kialakulâsâban. Szâmos integrâlt algoritmussal, mint példâul a Genome Analyser Tool Kittel (GATK) direkt kapcsolat létesitheto azokhoz az adatbâzisokhoz, amelyekbol a referenciagenomok allél-megoszlâsi adatait elérhetjûk, illetve in silico funkcioelem-zéseket is végezhetûnk [25]. A bioinformatikusok szerepe ezekben a lépésekben elengedhetetlen. Mindezek utân egy olyan adatbâzist kapunk, amely tartalmazza az összes beazonositott variânst és a hozzâjuk tartozo adatokat. Ezeket variant calling fâjloknak (vcf) hivjuk.

A klinikai genetikus munkâja igazâbol itt kezdodik. Az azonositott eltérések klinikai interpretâciojâban figye-lembe kell venni az adott eltérés allélgyakorisâgât, funk-cionâlis következményét, valamint a különbözo mutâci-os adatbâzisokban (dbSNP, clinVar, HMGD, OMIM) târolt informâciokat. Ismert gének esetében ez egyszeru

szurésekkel viszonylag könnyen kivitelezhetб. A követ-kezбkben phaeochromocytoma/paraganglioma szind-rómákban az NGS-alapú vizsgálatokkal nyert eredmé-nyeket foglaljuk össze.

A phaeochromocytoma/paraganglioma szindrómák klinikai genetikai diagnosztikája NGS-módszerekkel

Amplikonszekvenálás

Mind ez idáig három tanulmányban vizsgálták a phaeo-chromocytoma/paraganglioma szindrómák hátterében álló géneket génpanelekkel. Rattenberry és mtsai amp-likonszekvenálást végeztek GS Junior készülékkel. Ösz-szesen 9 gén egyideju vizsgálatára terveztek amplifiká-ciót [26]. Welander és mtsai 14 gén vizsgálatát végezték el Illumina MiSeq platformon [27]. Ezek a tanulmányok e^sorban az NGS metodikai alkalmazhatóságát kíván-ták igazolni. A GS Juniorral végzett analízis a 77 ismert variánsból mindösszesen egyet nem talált meg, a mód-szer szenzitivitása 98,7% volt. A második tanulmány fб eredménye az volt, hogy a bioinformatikai elemzés és az alkalmazott szurések alapján a szenzitivitás 82,9-100% között változott. A specificitás mindkét módszer eseté-ben elmaradt a jelenlegi rutin laboratóriumi diagnoszti-kában használt mérбmódszerekétбl. A GS Junior-mérés során a 164 beazonosított eltérés közül 46 álpozitív volt, ami e^sorban a homopolimer hibájára volt visszavezet-hetб. A szerzбk ugyanakkor hangsúlyozták, hogy az elemzésben alkalmazott szurésekkel ezek száma jelentб-sen csökkenthetб [26]. A MiSeq készülékkel a módszer specificitása >99% volt, egyértelmuen jelezve a módszer alkalmazhatóságát [27].

Ezeknek az eredményeknek a megerasítésére Crona és mtsai ebben az évben publikált tanulmányukban a bioinformatikai algoritmusokat elemezték [28]. A MiSeq ké-szülékhez fejlesztett MiSeq Reporter beazonosította az összes eltérést, de mintánként mintegy 100 álpozitív eltérés is elбfordult. A CLC Genomics workbench elneve-zésu programcsomag 8-11 álnegatív eredményt közölt (szenzitivitás: 76,9-85,1%). A sze^k által kifejlesztett saját algoritmus teljes^képessége a két módszer között helyezkedett el [28]. Mindezek az eredmények óvatos-ságra intenek; az NGS-alapú mérések eredményeinek a klinikai döntéshozatalba történб integrálása elбtt érde-mes több bioinformatikai elemzést elvégezni, illetve ha-gyományos molekuláris biológiai módszerekkel kell az eredményeket megerasíteni.

Exomszekvenálás eredményei phaeochromocytoma/paraganglioma szindrómás betegekben

Az exomszekvenálás jelentбségét phaeochromocytoma/ paraganglioma szindrómás betegek genetikai vizsgálatá-

ban jôl mutatja, hogy mind a MAX, mind az MDH2 géneket ezzel a môdszerrel fedezték fel. Ezek az eredmé-nyek kutatâsi projektek révén születtek, ahol olyan bete-geket vizsgâltak, akik az addig ismert génekben nem hordoztak eltéréseket. Az exomszekvenâlâs sorân olyan génhibâkat kerestek, amelyek a betegekben heterozigôta formâban voltak jelen, nem szerepeltek korâbbi geneti-kai adatbâzisokban és szegregâlôdtak a betegséggel. A daganatszövetek genetikai vizsgâlata alâtâmasztotta az autoszomâlis dominâs öröklésmenetet, és megâllapitot-tâk, hogy mind a MAX, mind az MDH2 klasszikus tu-morszuppresszor gének [14, 16].

A fenti eredmények azonban nem feMtlenül jelentik azt, hogy uj gének kimutatâsâra az exomszekvenâlâs lenne a vâlasztandô genetikai vizsgâlômôdszer. Amint a cél-zott amplikonszekvenâlâsok esetében emlitettük, a môd-szer szenzitivitâsa és specificitâsa nem éri el a 100%-ot. Jelenleg az exomszekvenâlâs a klinikai genetikai diag-nosztikâban mint szuromôdszer terjedt el. A vizsgâlatok sorân elsosorban azokat a géneket elemzik, amelyek pa-togenetikai szerepe mâr bizonyitott (ilyenek a jôl ismert onkogének, illetve a phaeochromocytoma/paraganglio-ma szindrômâkkal összefüggo gének). A môdszerrel ter-mészetesen egyéb monogénes kôrképek esetében is könnyen szurhetoek és elemezhetok az adott génrol szârmazô adatok. Mindezzel együtt jelenleg nem ismert olyan komplex vizsgâlat, amely egyértelmuen vizsgâlta volna az exomszekvenâlâs teljesitoképességét a rutindi-agnosztika sorân. Az eredményeket befolyâsolja a könyv-târkészités môdja és a bioinformatikai adatfeldolgozâs. Az ismert gének lekérdezése utân âtlagosan több szâz vagy akâr ezer olyan variâns is maradhat, amelyek poten-ciâlisan patogének (fehérjeszerkezetet kritikusan érinto mutâciôk) lehetnek. A valôban betegséget okozô eltéré-sek tényleges patogenetikai szerepe csak genetikai asszo-ciâciôs vizsgâlatokkal bizonyithatô.

Tovâbbi kritikus elem a korâbban is emlitett kôpia-szâm-vâltozâst mutatô régiôk és a pszeudogének kérdé-se. Sajât tapasztalatunk alapjân példâul a CYP21A2 gén (a 21-hidroxilâz-defektus kialakulâsâért felelos gén) ese-tében több mint 20 minta két különbözo platformon végzett exomszekvenâlâsa nem talâlt egyetlen eltérést sem, holott Sanger-szekvenâlâssal szâmos gyakori poli-morfizmus volt kimutathatô. Jelenleg a legtöbb klinikai genetikai intézet az exomszekvenâlâst komplex elovizs-gâlatként hasznâlja és testreszabott algoritmusokkal az adott betegséggel összefüggésbe hozott géneket elemzi [24, 29].

Etikai kérdések

A technolôgiai kérdések mellett fontos khxrnünk a vizsgâlat sorân felmerülo etikai kérdésekre is. Jelenleg a vizs-gâlatba tôrténo beleegyezo nyilatkozatban a vizsgâlt egyén genetikai tanâcsadâst követoen nyilatkozik arrôl, hogy milyen vizsgâlatba egyezett bele és milyen felvilâ-gositâsra tart igényt. A jelenlegi ajânlâs szerint a diag-

nosztikai célbôl végzett vizsgâlatok esetén az eredmé-nyek közül a betegségével összefüggo géneltérésekrol kaphat tâjékoztatâst egy ujabb genetikai tanâcsadâs sorân. Az NGS-alapu technolôgiâk szükségessé teszik uj tipusu beleegyezo nyilatkozat hasznâlatât. Ebben ki kell térni a vizsgâlat môdjâra, az adatok elemzésére, târolâsâ-ra, a közölheto eredményekre és az incidentâlis eltérések kezelésére. Az incidentâlisan felfedezett eltéréseknek je-lenleg mâsodlagos szerepe van, âltalâban nem kerülnek az eredményt közlo dokumentumba. A kérdés rendkivü-li fontossâgâra hivja fel a figyelmet Vrijenhoek és mtsai 2015-ben publikâlt tanulmânya [29]. Hypertrophiâs cardiomyopathia genetikai hâtterének vizsgâlata sorân 8 genetikai központ NGS-alapu vizsgâlati stratégiâjât ha-sonlitottâk össze. Elsodleges céljuk nem a môdszerek technikai összehasonlMsa volt, hanem a kiadott genetikai vizsgâlati eredmények közötti egyezoség/különbö-zoség feltârâsa. A 8 központ eltért a vizsgâlômôdszerek-ben, mind a technolôgiai, mind az adatértékelésben. A 8 tezpon^l kettoben nem igazoltâk a betegség kialaku-lâsâért felelos eltérést, helyette az egyik központban a Fâbry-kôr diagnôzisât âllapitottâk meg, mig a mâsik központ negativ eredményt adott ki. Az a központ, amely negativ eredményt kapott, hagyomânyos Sanger-szekvenâlâssal igazolta a patogénhibât, megerositve azt a stratégiât, hogy a klinikai diagnosztikâban a Sanger-szekvenâlâssal is megerositett eredmény elfogadhatô. A ta-nulmâny összehasonlitotta a beleegyezo nyilatkozatok tartalmât is; a 8 közül 3 központban a hasznâlt nyilatko-zat nem tartalmazta a vizsgâlat céljât (kutatâsi vagy diag-nosztikai cél), illetve, hogy hogyan kezeljék a mâsodla-gos eredményeket (szorosan a betegséggel nem összefüggo gének eltéréseit). A szerzok, összhangban az Eurôpai Humângenetikai Târsasâg ajânlâsâval, multi-diszciplinâris team összehívâsât javasoljâk, amelyben kli-nikai genetikus, laboratôriumi szakember, klinikus és bioinformatikus együttesen alakitja ki a vizsgâlati straté-giât, a beleegyezo nyilatkozat tartalmât és azokat a mi-noségi standardokat, amelyek szükségesek az NGS technikai kivitelezéséhez, tovâbbâ a validâlâs mikéntjét és az eredménytozlés tartalmât.

Kôvetkeztetések

Az NGS-alapu vizsgâlômôdszerek rohamosan fejlodnek és a klinikai genetikai diagnosztikâban is terjednek. A technolôgiai fejlesztések révén a vizsgâlatok âra kedvezo, ami rendkivül csâbitô. Szâmos kereskedelmi szolgâltatô kinâl elso hallâsra kedvezo âru vizsgâlatokat, amelyek fel-hasznâlâsa a klinikai döntéshozatalban csak az eredmények validâlâsât követoen fogadhatô el. Feladatunk a tâjékoztatâs, a figyelem felhivâsa, hogy a klinikai diagnosztikâban csak az olyan môdszer megengedett, amely technikailag validâlt és teljesitoképessége bizonyitott. Irânymutatônak kell tekinteni az orvosszakmai târsasâ-gok ôvatossâgra into szakmai ajânlâsait.

Anyagi tdmogatds: A kôzlemény elkészitése a Bionikai Innovâcios Központ kutatâsi tâmogatâsâval valosult meg.

Szerzoi munkamegosztds: P. A.: Témavâlasztâs, adatok elemzése, kézirat megirâsa. L. I., B. H., B. K.: Adatok gyujtése, elemzése, ôsszehasonlitâsok elkészitése, kézirat véleményezése, javitâsa. R. K.: A kézirat kritikai észrevé-telezése, javitâsa. A cikk végleges vâltozatât valamennyi szerzo elolvasta és jovâhagyta.

Érdekeltségek: A szerzoknek nincsenek érdekeltségeik. Köszönetnyilvänitas

A szerzök köszönetüket fejezik ki a Bionikai Innovâcios Központ kuta-tâsi tâmogatâsâért. Patocs Attila az MTA „Lendület" pâlyâzat nyer-tese.

Irodalom

[1] Toledo, R. A., Dahia, P. L.: Next-generation sequencing for the diagnosis of hereditary pheochromocytoma and paraganglioma syndromes. Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes., 2015, 22(3), 169-179.

[2] Lenders, J. W., Duh, Q. Y., Eisenhofer, G., et al.: Pheochromocytoma and paraganglioma: an Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2014, 99(6), 19151942.

[3] Karagiannis, A., Mikhailidis, D. P., Athyros, V. G., et al.: Pheochromocytoma: an update on genetics and management. En-docr. Relat. Cancer, 2007, 14(4), 935-956.

[4] Patocs, A.: Multiple endocrine neoplasias and other hereditary endocrine tumor syndromes. In: Leövey, A., Nagy, V. E., Paragh, G., et al. (eds.): Endocrine and metabolic disorders practical handbook. [Multiplex endokrin neoplasiâk és egyéb örökletes endokrin tumor szindromâk. In: Leövey, A., Nagy, V. E., Paragh, G. et al. (szerk.): Az endokrin és anyagcsere-betegségek gyakor-lati kézitonyve.] Medicina Könyvkiado, Budapest, 2010. [Hungarian]

[5] Baysal, B. E., Ferrell, R. E., Willett-Brozick, J. E., et al.: Mutations in SDHD, a mitochondrial complex II gene, in hereditary paraganglioma. Science, 2000, 287(5454), 848-851.

[6] Niemann, S., Müller, U.: Mutations in SDHC cause autosomal dominant paraganglioma, type 3. Nat. Genet., 2000, 26(3), 268-270.

[7] Astuti, D., Latif F., Dallol, A, et al.: Gene mutations in the suc-cinate dehydrogenase subunit SDHB cause susceptibility to familial pheochromocytoma and to familial paraganglioma. Am. J. Hum. Genet., 2001, 69(1), 49-54.

[8] Hao, H. X., Khalimonchuk, O., Schraders, M., et al.: SDH5, a gene required for flavination of succinate dehydrogenase, is mutated in paraganglioma. Science, 2009, 525(5944), 1139-1142.

[9] Burnichon, N., Brière, J. J., Libé, R., et al.: SDHA is a tumor suppressor gene causing paraganglioma. Hum. Mol. Genet., 2010, 19(15), 3011-3020.

[10] Yeh, I. T., Lenci, R. E., Qin, Y., et al.: A germline mutation of the KIF1ß gene on 1p36 in a family with neural and nonneural tumors. Hum. Genet., 2008, 124(3), 279-285.

[11] Ladroue, C., Carcenac, R., Leporrier, M., et al.: PHD2 mutation and congenital erythrocytosis with paraganglioma. N. Engl. J. Med., 2008, 359(25), 2685-2692.

[12] Qin, Y., Yao, L., King, E. E., et al.: Germline mutations in TMEM127 confer susceptibility to pheochromocytoma. Nat. Genet., 2010, 42(3), 229-233.

[13] Yao, L., Schiavi, F., Cascon, A., et al.: Spectrum and prevalence of FP/TMEM127 gene mutations in pheochromocytomas and paragangliomas. JAMA, 2010, 304(23), 2611-2619.

[14] Comino-Méndez, I., Gracia-Aznárez, F. J., Schiavi, F., et al.: Exorne sequencing identifies MAX mutations as a cause of hereditary pheochromocytoma. Nat. Genet., 2011, 43(7), 663-667.

[15] Castro-Vega, L. J., Buffet, A, De Cubas, A A, et al.: Germline mutations in FH confer predisposition to malignant pheochro-mocytomas and paragangliomas. Hum. Mol. Genet., 2014, 23(9), 2440-2446.

[16] Cascón, A., Comino-Méndez, I., Currás-Freixes, M., et al.: Whole-exome sequencing identifies MDH2 as a new familial paraganglioma gene. J. Natl. Cancer Inst., 2015, 107(5), pii: djv053.

[17] Buermans, H. P., den Dunnen, J. T.: Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochim. Biophys. Acta, 2014, 1842(10), 1932-1941.

[18] Rothberg, J. M., Hinz, W., Rearick, T. M., et al.: An integrated semiconductor device enabling non-optical genome sequencing. Nature, 2011, 475(73 5 6), 348-352.

[19] Bentley, D. R., Balasubramanian, S., Swerdlow, H. P., et al.: Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature, 2008, 456(7218), 53-59.

[20] Merriman, B., Rothberg, J. M.: Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis, 2012, 33(23), 3397-3417.

[21] Quail, M. A, Smith, M., Coupland, P., et al.: A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics, 2012, 13, 341.

[22] Rothberg, J. M., Leamon, J. H.: The development and impact of 454 sequencing. Nat. Biotechnol., 2008, 26(10), 1117-1124.

[23] Choi, M., Scholl, U. I., Ji, W., et al.: Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2009, 106(45), 19096-19110.

[24] Van El, C. G., Cornel, M. C., Borry, P., et al.: Whole-genome sequencing in health care: recommendations of the European Society of Human Genetics. Eur. J. Hum. Genet., 2013, 21(6), 580-584.

[25] DePristo, M. A, Banks, E., Poplin, R., et al.: A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet., 2011, 43(5), 491-498.

[26] Rattenberry, E., Vialard, L., Yeung, A., et al.: A comprehensive next generation sequencing-based genetic testing strategy to improve diagnosis of inherited pheochromocytoma and paragan-glioma. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2013, 98(7), E1248-E1256.

[27] Welander, J., Andreasson, A, Juhlin, C. C., et al.: Rare germline mutations identified by targeted next-generation sequencing of susceptibility genes in pheochromocytoma and paraganglioma. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2014, 99(7), E1352-E1360.

[28] Crona, J., Verdugo, A. D., Granberg, D., et al.: Next-generation sequencing in the clinical genetic screening of patients with phe-ochromocytoma and paraganglioma. Endocr. Connect., 2013, 2(2), 104-111.

[29] Vrijenhoek, T., Kraaijeveld, K., Elferink, M., et al.: Next-generation sequencing-based genome diagnostics across clinical genetics centers: implementation choices and their effects. Eur. J. Hum. Genet., 2015, 23(9), 1142-1150.

(Patócs Attila dr., Budapest, Szentkirályi u. 46., 1088 e-mail: patocs.attila@med.semmelweis-univ.hu)